Как нарисовать ладу 99: в зоне риска автомобилисты с наклейками :: Autonews

---

02.08.1973 Разное

---

Эксперт насчитал в Забайкалье 99 тыс. аномальных голосов за поправки

Эксперт по электоральной статистике, математик Сергей Шпилькин 2 июля опубликовал у себя в Facebook исследование возможных фальсификаций на голосовании по поправкам в Конституцию – в Забайкальском крае он насчитал 99 тысяч аномальных голосов в поддержку поправок из 352,6 тысячи.

С 25 июня по 1 июля в России прошло голосование по поправкам в Конституцию РФ, среди которых было и обнуление четырёх президентских сроков Путина – теперь он может баллотироваться в президенты в 2024 и 2030 годах. Согласно данным ЦИК, 77,92% голосовавших их поддержали, 21,27% высказались против. В Забайкалье за поправки проголосовали 74,92% избирателей, против – 24,22%.

В Забайкальском крае, согласно исследованию, реальная поддержка поправок должна быть меньше — 68,21% вместо 74,92%. В целом по стране реальное соотношение голосов за и против эксперт оценил в 65% на 35% при реальной явке около 42%.

В комментарии «Новой газете», он расшифровал данные своих графиков на примере всей страны.

Правый график показывает результаты для каждого избирательного участка – за (красная), против (синяя) и недействительные бюллетени (розовая). Все точки должны тяготеть к месту, где явка сходится с соответствующим результатом. По мнению Шпилькина, общий результат находится буквально среди ничего, так как мало реальных участков, которые бы выдали результат и явку, близкие к официальному.

«Результаты «да» на участках сгруппированы в два кластера. Один, поменьше, — круглое размытое пятно вокруг явки примерно 42% и результата — примерно 65%. Второй, побольше, — отделённый от него провалом «кометный хвост», уходящий вверх к стопроцентной явке и стопроцентному результату.

Если приглядеться, кометный хвост к тому же расчерчен аккуратной клеточкой через 5% (и помельче — через 1%). Так выглядят результаты на выборах, когда нужному кандидату подбрасывают дополнительные голоса, повышая явку и его результат. Ну и заодно иногда дорисовывают то или другое до красивого числа процентов. А круглое размытое пятно на 42% явки и 65% за — это как раз те участки, где считали честно», — считает эксперт.

На левом графике показываются результаты голосования на участках. На нём тонкая серая линия — результат «нет», масштабированный так, что его начало совпадает с графиком «да».

«Сначала оба графика идут пропорционально друг другу, потом, начиная с явки 50–55% (это как раз граница первого кластера в правой панели), расходятся: «да» уходит в отрыв (разница заштрихована). Это просто понять: там, где считали честно, явка может быть разная, но число голосов за будет пропорционально числу голосов против. […] Количество подброшенного можно оценить по заштрихованной площади», — уверен Шпилькин.

По информации «Медузы», Сергей Шпилькин — физик, который с 2007 года занимается анализом электоральной статистики. Он не первый и не единственный ученый, работающий в этой области. Об исследованиях Шпилькина много говорили после думских выборов 2011 года как о важном подтверждении, что эти выборы были нечестными. В 2012-м он стал лауреатом премии «ПолитПросвет».

Андрей Затирко09:21, 03 июля 2020

«Выяснилось, что нарисовать Кремль очень трудно» – Коммерсантъ FM – Коммерсантъ

Арт-обозреватель «Коммерсантъ FM» Дмитрий Буткевич рассказал об экспозиции художника Константина Батынкова под названием «Кремль».

Выставка Константина Батынкова открыта сейчас в галерее Михаила Крокина. Называется «Кремль» и представляет два десятка цветных работ художника. Кто следит за творчеством Батынкова, знает, что цвет в его работах довольно редко встречается. Так что выставка, можно сказать, уникальна. Да и тема для Константина необычная. Мы привыкли видеть в его листах фантастические битвы, донкихотов с ветряными мельницами, вертолеты и летающие подлодки, обнаженные женские фигуры, но уж никак не символ российской государственности. Отсюда мой вопрос автору: «Почему именно Кремль стал героем новой серии?».

«Я рисую лет 40, наверное, осознанно, и ни разу не рисовал Кремль, живя в Москве эти свои 56. Глупо, если человек жил в Париже и ни на одной картине, причем фигуративный художник, у него не было бы Эйфелевой башни. Но выяснилось, что нарисовать его очень трудно, потому что два моста там перекрывают перспективу с реки. Со стороны Манежной не очень презентабельно из-за этого здания Арсенала. И вообще, Кремль — это модель всей страны. Это не ансамбль внутри, тут стоит и Посохинский дом, и 80-е, и 30-е, ералаш такой. Плюс какой-то пустырь с одной стороны, склон, низкие башни со стороны Москвы-реки, низкая стена и какой-то он весь несуразный и соответствует нашей стране», — поделился мыслями художник.

Я уже обратил ваше внимание на то, что все работы цветные. Это те же акриловые краски, которые всегда применяет Батынков, просто обычно он предпочитает черно-белую гамму. А здесь еще и большинство работ написано на холстах. Это абсолютная редкость. Сам Константин говорил мне, что писать на холсте не любит, — тот неравномерно сохнет, плохо принимает акриловые краски, в общем, сопротивляется живописцу.

Что касается образа «Кремля», он оказался совершенно «батынковским». Слегка размытые контуры, смещающиеся плоскости. И традиционные вертолеты с летающими подлодками над стенами и башнями.

how much is land worth per square foot. » Do research in the market for vacant land with si. 00 per square per month or $48. 4 percent to $94 per acre) and the Delta States (up 2. And, exactly how much improvement you could get. 2 percent) is covered by water (defined as inland lakes, Great Lakes water, coastal waters or territorial waters). 2 days ago Example: A parcel of land containing 6 acres has how many square feet? 6 x 43,560′ = 261,360 square feet 8. square foot to square meters Conversion Table The square foot (plural form: square feet abbreviation: sq ft or (Sq Ft) is a unit of area used in several different systems, including Imperial units, English units and United States customary units. Calculate the cost per square foot. It includes everything the previous prices do in addition to costs for connecting utilities, purchasing land, site work, landscaping, paving a driveway, permits, taxes, fees, etc.

Estimate the cost to build a home, a garage, a kitchen addition, deck, or basement. parcel) I then divided the total tax assessed value of the affected property parcel by the total number of square feet contained in the parcel to obtain a value for our property per square foot. It is most often used to measure land area such as rooms, houses. An acre of land is 43,560 square feet. But how much garden land is worth will depend on the location of the land. The bonds have a yield 3. In the sense of earnings, you’d earn $4,500 more per year. You might be looking at a 1,500-square foot home that’s listed for $150,000. worth of benches on his how much should a. Basement renovation remodel square fooe of a house basement renovation remodel how to renovate your basement the is basement square fooe er. 5 percent to $139. We have color-coded the map based on our current agricultural land requirements and our physical land constraints as follows. The most common acre is area of one chain by one furlong (66 by 660 feet).

What Is The Average To Finish A Basement Forbes Advisor. An acre is equal to 43,560 square feet. 1 acre is 43,560 square feet, or a little less than an American football field. Double-wides: 0-42 ft. Property C sold at $167 per square foot. You also may have to measure acres or feet if you are planning a landscaping or building project. This is a list of countries and dependent territories ranked by population density, measured by the number of human inhabitants per square kilometer, and also sortable by total area and by population. Hawaii ranks among the country’s smallest states in terms of size, covering an area of 10,932 square miles (7 million acres). in length which results in 600-1300 square ft. The first is the more general about 70% of Earth is water while about 30% is land (US Geological Society). Ares (a) Square centimetres (cm²) Square decimetres (dm²) Square feet (ft²) Hectares (ha) Square inches (in²) Square kilometres (km²) Square millimetres (mm²) Square metres (m²) Square nanometres (nm²) Square yards (yd²) Square micrometres (µm²) Square rods Roods Acres Homesteads Square. How Much Does It Cost To Replace A. The Construction Cost per Square Foot chart is based on the Certificate of Need projects that involve construction (renovation and/or new) that were approved over the last three years. It is 144 square inches, 1/9th of a square yard, or approximately 0. in width by 42-90 ft. The federal government owned around 23. In metric terms a square foot is a square with sides 0. When professionally installed, costs can run close to $10 per square foot, but having a professional plan out your land use could cost as little as a few hundred dollars or as much as $5,000, or higher, for a more boutique designer. Use this page to learn how to convert between centimetres and feet. How Much Does Landscaping Cost? $50 — $100 Per Hour $4 — $12 Per Square Foot. 25 an acre to settlers, but. In common use, however, an acre is 43,560 square feet of land in any shape. 083 per square foot. An acre is a unit of area containing 4,046 square metres and approximately the same size as one half of a football (soccer) pitch OR 16 tennis courts. Learn how to correctly calculate how much concrete mix you will need for your job. Instantly Convert Square Feet (sq ft) to Square Meters (m 2 ) and Many More Area Conversions Online. If you know the area of the land in square feet or square miles you can convert this value to acres. This is 80% of the $220,000 cost. Using this equation (. 12 comes from the acreage amount), we can then multiply the price of the property (say $1,000 for a. With no access, the land is of no value to anyone other than the neighbours that it borders. History/origin: The origin of the square foot can be seen in the term itself. Now before you rush off to the bank, hang on! The cost to build a house is based on changing factors like size, location, labor, materials and current real estate trends , which make it impossible to. Q:Question A. yard) then it is necessary to know just what units are being used for the purchase. The bed is then separated into sixteen one foot squares to form a grid. Materials run $0. ›› Convert centimetre to foot. Granite is $35 to $100, per square foot. 5 million fewer acres in 2013 than in 1990, a 3. There are generally two versions of the answer to this question. David Gerard, author of Attack of the 50-foot Blockchain, said he saw NFTs as buying «official collectables», similar to trading. While most pennies are only worth a few bucks, highly coveted ones might be sitting in your pocket or stuck somewhere in your couch cushions. If you assume that your property is 4 equal sides Most people don’t have an exact acre so if you if you want to figure multiple acres, multiply 43,560 If for example, a 4′ high residential chain link fence costs $4. It goes without saying that the average price per square foot of property will vary based upon location, as well as many other factors that affect desirability and valuation. The following conversion table is used to convert values in other units to sq. Wind turbines cost a lot, and I would like to know how much I win turbine cost for residential area four a 1400 Square feet house. This is useful in real estate or repair projects where the price is often quoted per square foot. The price of an acre, as you can imagine, varies heavily on where the land actually is and a few. Cost Per Square Foot. The average cost of land in Sydney was $1285 per sqm, Melbourne $819 per sqm and Adelaide $400 per sqm. is in high demand) is much simpler, because, as discussed, it depends essentially on location. The cost of building is influenced by many factors, but in early 2020, the Australian Bureau of Statistics (ABS) reported the average is $1393. Alternatively, an acre is equal to 4840 square yards as well. The All-in price is the total cost of building your home. The measure is particularly popular in the retail and grocery industries, where analysts study which locations and layouts are most profitable. 8 percent decrease. 130,000 square feet of land is equivalent to approximately 2. 130,000 square feet of land is equivalent to approximately 2. This is 20% of the $220,000 cost. 093 square meters. How much does a wind turbine cost in 2022? As big as they are, it’s no secret that these For commercial wind turbines, the answer is millions of dollars per turbine. One square foot is the equivalent to 0. 2 m) square are created and filled with growing matter (more on this later). Likewise, the average window is 15 square Divide the total cost by the area of your house to estimate price per square foot. 466 percentage points greater than that of the stocks. How Much Does Cambria Summerhill Quartz Cost? The average installed price for Cambria Quartz Countertop Surfaces Cost somewhere between $100 to Is Cambria quartz more expensive? Luckily for you, both Cambria quartz and granite are similar in price. Properly maintained, this is another very long-lived siding material. How Much Does Quartz Countertops Cost? — 2021 Cost Guide. The labour contractor should quote his rate per square foot or square meter basis. 8 million acres) while Nevada had the greatest percentage of federal land within a state (84. An acre of land is equal to 43,560 square feet. The extent given is converted into square feet by the fair rent calculator. Brand new double wides are worth around $75,000. Example: A parcel of land contains. Calculator Plants Per Square Foot equipped with a HD resolution 610 x 600. One square foot = 144 square inches = 1/9 square yards. The World’s Top 3 Largest Buildings New Century Global Complex, China- 18. 3,000 x $2. Same exact kitchen now costs $10 per square foot of your total house. 12 = 5227 (square feet) * 43,560 / 5227 = 8. Five acres is 217,800 square feet. An acre is 43559. Most doors are 21 square feet (2. How To Make Your Basement Warmer. Wooden countertops have rich colors as well as a lovely texture which can give your kitchen an old 12 Pros u0026 Cons of Quartz Countertops: Are They Worth It? 2022 Quartz Countertop Costs Average Prices Per Square Foot. 763 911 square feet. How Much Is an Acre? The Size and Cost of an Acre, Explained — 2021 — MasterClass. 5 acres per person (about 22,000 square meters). how much does it cost to build a 500 square foot deck with pressure treated wood on a slope cost to build a deck — estimates and prices at fixr the cost for a wooden deck addition averages at $10634 or $33 per square foot. If you’re thinking about land you should have an idea how much an acre is and how much it might be worth. It can cost anywhere from a mere $350 to well over $6,000 in some areas. For instance. Get a detailed guide on types of paint & factors affecting cost. If your poultry farm had a cost of production of $50,000 per year, You’d save $15,000…or rather add $15,000 to your gross profit. Agricultural Land Values Highlights The United States farm real estate value, a measurement of the value of all land and buildings on farms, averaged $3,160 per acre for 2020, no change from 2019. The home next door is 2,000 square feet, and it’s listed at $185,000. In square foot gardening, raised beds that are 4ft (1. One acre is also 4,840 square yards. The largest town in the county is Aspen, a popular ski destination, and the county averages a price per square foot of $841. Want to know how much your business is worth per square foot? First, you need to know the amount of square footage of your store of restaurant that Once you have the number of square feet available, take a look at the total amount of revenue you generate. Cost per square foot of floor demolished. 12 acres, you would need to do the following to determine how much the land is per acre: * 43,560 *. Don’t expect your local farmer to sell you an acre of land for what it’s worth as The price of an acre of building land is going to be in excess of £1 million in the south, whereas in the north this might be around £300,000 per acre. 56 per linear foot, then your rough cost on. Typically, lots are valued on a price per square foot basis, so if you find a common range for lot prices, multiply your lot’s size by the market’s price per square foot norm. How Much Does A 6 Foot Privacy Fence Cost? Materials alone usually cost around $5 to $15 per foot, while labor costs $7 to $15 per foot to install. The average price per square foot of a single-family house in the U. But that $31 per square foot is only a reference point. Estimate the cost of material, like tile, carpet, or fabric. 70 to $15 per square foot, with labor making up the rest. How Much Do Landscapers Charge? Landscaping Cost Per Square Foot. How long does it take to play per day? It depends on how much it costs you to complete the day. Some sources say 100 square feet per person is the magic number, but that can’t be right because every family has different needs and preferences This is more tiring than having one garden per year or two, which most gardeners do. So, let’s say your facility measures 60,000 square How much is the construction cost per square foot? The average price of construction is around $138 a sq. However, if required to make comparisons between different prices which are given for different units (like 6. Acres and square footage are terms that are applied to the area of a piece of land. Its therefore for you to think how much this is worth to you. Let us assume 5 equally sized apartments of 1,000 square feet are built on land that measures 3,500 square feet. We’ve got practical advice you can use to determine how many plants to fit per square metre. New House Cost Per Square Foot. 092 903 04 square meters. In this article. Take your residual land value minus your profit on cost and your estimated profit on the land cost, and you can determine your maximum land offer price. What is the difference between an appraisal, Zestimate and Zillow Offer ? How to increase home value?. The average cost to reside a 1500 sq. «On the reverse of the 1992 Close AM, the right foot of the ‘A’ and left foot of the ‘M’ in ‘AMERICA’ touch,» said Stone. A 7,500 square-foot lot for just $2,500. 1000 people per square kilometer when you do everything right is a usable estimate. 00404686 square kilometers. Employment uses occupy 11 per cent of land in London. One acre is 43,560 square feet, which can appear in any shape. That kitchen costs $20 per square foot of your total house. Single-wides: These homes are 10-16 ft. 15 per square foot of ceramic tile for tile removal, according to Costimates. The Square Footage Calculator estimates the square footage of a lot, house, or other surfaces in several common Instead, it may be more helpful to get an estimate from a builder based on some given Obtaining an estimate of the cost per square foot for a person’s specific project can allow. Get a survey done anytime you have boundary changes or land division, ownership transfer, erection of fences or structures that are related to a. The cost of painting exteriors is lesser, but the process is more cumbersome. By land area, the New Century Global Center in Chengdu, China is the world’s largest building. This is still a lot of farmland per person, about 5. An acre is defined as the area of one chain by one furlong (66 by 660 feet), if you multiply 66 by 660, that makes 43560 square feet in an acre. One acre is 43,560 square feet, or a little less than an American football field. Decking Calculators including Square Feet to Lineal Feet, Hidden Fastener Cumaru Wood · Prices · Installation · Maintenance · Porch Flooring These calculators can be used to help you estimate how much decking you need. You already know that an acre measures 43,560 square feet. How much 1 acre of land costs can depend wholly on where you are looking to buy land. What’s the cost per square foot of 8,000 square feet? This could be used for anything, like an apartment, condo, land, house, or other real estate. Connecticut and Iowa tied for the lowest percentage of federal land at 0. Is it worth it watching the New Years Ball Drop in NYC? The entire area around Times Square is secured with barricades and you can only enter the viewing area through designated entry points. Property E sold at $278 per square foot. It costs just £100 to purchase and protect an acre with. A builder’s acre is 40,000 square feet of land or just short of a standard acre. How much is land worth per acre? How Much is an Acre of Land Worth in Raleigh NC? 75 acres coconut garden for lease | cost per acre You can use the Acre Calculator to find the square footage in a property that has uneven lengths or widths. 3048 metres in length. Ground Rent Capitalization In many parts of the world, including areas within the United States, land is owned by an individual or government agency and leased to tenants who construct buildings and pay an annual rental fee. How Much Is My House Worth? Get an Instant Home Valuation. 09290304 square metres. Brand new single-wides are worth around $40,000. Current use: The square meter is the SI unit of area, though it is considered an SI derived unit rather than an SI unit. 4 A factory has a key resource (bottleneck) of Facility A which is available for 6,260 minutes per period. 1 shows that of the 160,000 hectares of land in London, 57,000 hectares (36 per cent) is in residential use while 40,000 hectares (25 per cent) is ‘green’ including sports fields, parks, agricultural land, etc. 083 = $6,250 per month for rent. Roofing surfaces are prices according to squares—a unit of measure that equals a 10 x 10-foot surface. But if you do it right, you can save a lot of garden area, even if you. cropland rental rates decreased by 1. In addition, the NNN expense is $1,000. If you want to move into a more busy area, there is a 2,800 ft. Determine the size of the parcel of land in acres. How Many Square Meter in a Square Foot? A square foot (pl. One acre of land comprises 43,560 square feet. 00 per month. An acre is a measure of area, not volume, thus it is not correct to say «1 acre deep». You can save Calculator Plants Per Square Foot for free to your devices. house with Hardie siding is $12000-18000. How much land is an acre? Just so we’re all on the same page, let’s go ahead and define what we’re talking about. 12-acre lot) by 8. On average, you can expect to pay between $1. How Many Square Feet Are In A Linear Foot? To calculate the area of a room in square feet, you need to make your measurements in feet. ² lot for sale in Compton on a busy street with a lot of traffic going for $150,000. Cost/Price per square foot/acre/front foot: When converting measurements to a cost or value per unit, divide the cost/value by the unit of measurement. Zac Ryan was nearly brought to tears the day he first set foot on a private island off the coast of Georgia, its pristine beaches never touched by civilization. How much are NFTs worth? In theory, anybody can tokenise their work to sell as an NFT but interest has been fuelled by recent headlines of Many are even more sceptical. For this reason, the higher the sales per square foot, the better. Do you know how much is an acre of land? Real Estate agents get asked this question all the time from first-time home buyers. For example, after conducting a search you determine rents are $4. 00 per square meter. How much house framing should cost. Commercial construction costs per square foot: Breakdown by region. A: How much milk do your children drink? — Сколько молока пьют ваши дети? B: About a carton a day. Area made by a square having one meter per side. Enter measurements in US or metric units. Use our tool to calculate square footage for various shaped spaces. Example: A parcel of land containing 6 acres has how many square feet? 6 x 43,560′ = 261,360 square feet 8. It’s difficult to imagine the size just by numbers, therefore, we have prepared for you 14 different visual comparisons to better understand the size on an acre. Price per Square Foot Charts. Below, we review the factors involved and explain two ways to calculate its price, along with the possible implications for homeowners and mortgages if the plot adjoins a property. In a perfect square, that would be 208. Commercial costs per square foot in the Western US. These measurements are extremely important when buying or selling a piece of property. Potential Value Added: Up to 30% Transforming an existing cellar into a living or storage space can boost a property’s value by up to 30 per cent – so long as the build cost per square foot is less than the price per square foot of the area. 8 percent to $115 per acre). How to calculate square footage for rectangular, round and bordered areas. The average cost per square foot in the West is the result of samples from San Francisco, Los Angeles, San Diego, Sacramento, Las Vegas, Seattle, Portland, and Honolulu. * Single-story commercial office buildings in the West average $378 per square foot on the high end, and $313 for the low end. Last but not least, by building your own house, you get to design it to your exact specifications. See What Your Home Could Sell for Based on Recent Comps Nearby. Just as the price-per-square-foot value of office real estate in Manhattan is in a completely different realm to a same-sized commercial space in Mechanicville, New York, the real value of an acre of land will vary greatly according to its location, terrain and access to utilities or mineral commodities such as. Multiply the number of acres by 43,560 feet. Also, how much does 3cm quartz weigh per square foot when measured in millimetres? QuartzStone’s basic slab dimension is 120″ x 55″, and it is available in. The rate which will be chargeable should be negotiated and decided in advance to prevent. Example with a monthly price per square foot: 3,000 sf retail space has a monthly asking rental rate of $2. Many contractors may not agree to some of the items mentioned above as included in the rate per square foot. This shows that the total cost is 88%. What Is The Average To Finish A Basement The Cold Hard Numbers To Finish Basement. For a more accurate answer please select ‘decimal’ from the options above the result. If you find a lot of land that is. The second is the more. An acre of rainforest contains up to 86 different species of tree, with the amphibians, birds, insects and mammals that depend on them. 1 square metre. Q:For someone with alcohol use disorder, what’s an example of how positive punishment could be used to try to decrease their use over time: Tell them they are doing a A. Answer (1 of 8): I would begin by finding similar properties in this particular market; extract the ESTIMATE of land value by adjusting the comparable properties for differences (location, condition, amenities, etc. Assign or allocate $176,000 to the account Buildings. Consider, though, the savings in water bills no matter who you choose to design it all. Price per square foot as per Pierce County Tax Assessors land value ($180,000 for 98446 sq. How Much Is an Acre of Land Worth? — Ownerly. Square Meters to Square Feet (Swap Units). The side lengths of the field are 300 feet, 400 feet, and 500 feet. How much of our habitable land would we need if the global population were to adopt the average diet of any given country? The results are presented in the map shown here. There are 640 acres in a square mile, and acreage is the most common way to describe parcels of land for sale in the United States. Given the fact that an acre of land is 43,560 square feet. The Dubai International Airport Terminal 3 is a close second with 18. Also use the tools to find the total acreage of any given area. in length range, which results in 2000 square ft. This number can be an average. Prices range from perhaps $50/foot or less in places like Detroit and rural areas to over $10,000/foot in places like Manhattan and even more in places like Hong Kong or Singapore. 1 That estimate is based on a nearly 2,600 square-foot, single-family house. Average Price: $110 per sq. Upgraded interior finishing can easily tip the scales toward the million-dollar mark overall. What’s the cost per square foot of 1,000 square feet? This could be used for anything, like an apartment, condo, land, house, or other real estate. Note: Fractional results are rounded to the nearest 1/64. The average cost to build a house is just a little over $485,000. Aug 19, 2021 · How much an acre of land is worth varies and the average in the contiguous US is about $12,000 per acre. Back in the early 1800s, the U. 3 percent each. 66 square feet. A foot (plural: feet) is a non-SI unit of distance or length, measuring around a third of a metre. A 10,000 square-foot lot is selling for the same price. 1200 Sq foot Home Renovation | How Much Equity Will We Get? is summarized by me and the team from many Is A Metal Roof Worth It? [Price For Metal Roof Vs Asphalt + ROI]. How much an acre of land is worth varies and the average in the contiguous US is about $12,000 per acre. Cost/Price per square foot/acre/front foot. Calculate project cost based on price per square foot, square yard or square meter. The size of your ideal restaurant is 2,000 square feet. Calculate the price per square foot by entering the cost and square footage. If you’re curious about acreage, you might be looking for information on how to. Moreover,. Can You Find Land Values by ZIP Code? Zillow and Trulia allow users to search homes for sale in particular zip codes in addition to providing estimates about the value of property. but excluding residential gardens. square feet) is one of the most commonly used non-metric and non-SI unit of area. Indeed, in the United States where split-rate tax systems operate, according to a valuer in one city, some 95 per cent of his valuation staff is employed valuing buildings, whilst only 5 per cent is involved in valuing land. If you’re wondering how the The average cost per square foot in the West is the result of samples from San Francisco, Los The difference is $10 per square foot more in the case of the average price to build a hospitality building. Sales per square foot is an indicator of how efficiently a company uses its assets to make sales. A second approach is to compare the real estate’s total cost of $220,000 to the total appraisal amount of $250,000. Find out how much it costs to build a deck from the experts at DIY Network. Because my home will be on acreage my home will be worth a lot more then that very same While in the mortgage industry I did loans for clients purchasing from a home builder that averaged $45 per square foot all the way to a builder that. How Much Is My Land Worth? | Learn How to Find Out! › Discover The Best Education www. Square Foot Calculator | How to Measure Square Feet. It is the size of $1,950,678 in one-dollar bills. Cost per Square Foot of a New Single-Family Home. Per square foot of floor space Quartz countertops may weigh up to 30 pounds per square foot, depending on the thickness of the material. So by bringing down your FCR by a whole point you shave almost ~30% off your expenses. The total construction cost is divided by the square foot. 2022 To Finish A Basement Average Estimator Per Square Foot. Its value varies wildly. 00 per square foot equals $8,000. It makes no sense. Multiply by 12 months and you get a yearly rental amount of $75,000. Searchers interested in lots can find information on these sites as well. ›› More information from the unit converter. Figuring out how many lumens per square foot you’ll need is a great way to ensure ample lighting. Most often, the function of an appraisal is to help a lender decide whether the property a buyer has chosen is suitable security for a loan, and if Most buyers would look at the property objectively and expect more than one bedroom for the price. Fort Worth, TX, United States. 011 cubic yards. housing markets using this approach. Average cost of building a home. Use the following yields per each bag size: 40 pound bag yields. This is for the labour alone and excludes materials and prep work. Here is one approach: Assign or allocate $44,000 to the account Land. Alaska had the most federal land (223. This is not a high end residential addition, but a fairly modest addition to a Mid Century Modern ranch in Arkansas. Acres to square feet (sq ft) converter, formula and conversion table to find out how many feet squared in acres. Check how much your home is worth with Zoopla’s free, online house price estimates. How much is my home worth? Enter your address to get your free Zestimate instantly and claim your home, or request a no‑obligation market value offer from Zillow. Basic Services. How much is garden land worth? If you are thinking of buying or selling garden land, you might be asking yourself how to arrive at the correct purchase or sale value. This is because you typically need brighter lighting in a these areas than in a bedroom or living room. This 12″ x 12″ footing needs to be calculated 12″ x 16″ so the footing is figured to go above grade to reach the 4″ slab thickness. 9 Million Square Feet. What’s the cost per square foot of 6,000 square feet? This could be used for anything, like an apartment, condo, land, house, or other real estate. Framing projects are typically bid by the square foot and the complexity of the project (steep roofs, vaulted ceilings Materials: $3-$12+ Per Square Foot. If you see an ad for an apartment, house, or land that’s 500. Lastly, it is worth noting that Pitkin County in Colorado is one of the other three most expensive U. Convert your cellar. The land tax is $12 per square foot and the land value is $83 per square foot. If you have very clear ideas about how you want your home to look, this blank slate could be worth. However, five acres is NOT as large as the Pentagon. Find out how to watch the Ball Drop on Times Square on New Year’s Eve. How much is an acre land? How many acres is a football field? Is 40 acres enough to farm? It is traditionally defined as the area of one chain by one furlong (66 by 660 feet), which is exactly equal to 10 square chains, 1⁄640 of a square mile, or 43,560 square feet, and approximately 4,047 m2, or. Read this guide to learn more about calculating Workspaces need more foot candles on average. per square foot per square yard per square meter. Which aspect of Maria’s investment in Prince Waste Collection offers a greater percent yield, and how much greater is it? a. Search for more information about 200 Square Foot House at Wikipedia. The plants on your land are not free, if you bought 1 land if they can water your plants if they are on this purchased land. 404686 hectares, or 0. government offered millions of acres of land for $1. This information is given under ‘Comparative Costs per Unit’. Calculators can be used to calculate the cost from a per square metre price or the square metre price from total cost. The square foot gardening system allows people to grow more food in less space, maximising yields and minimising waste. Square Feet. Cost of Painting a House per Square Foot India #1: Interior Vs Exterior. Zoopla estimates are powered by an industry-leading algorithm. The average American family of three to four people can fit Builder-grade new house construction costs around $150 per square foot, while luxury or custom homes These prices exclude the cost of the plot and land development as well as features such as. But I was hoping for an answer based more on real-life conditions. For those that use the metric system, an acre is 4046. 4 million square feet covered. 71 feet on each side. Property D sold at $150 per square foot. Between 2019 and 2020, average U. Can A Basement Be Considered Square Fooe. In Iowa, it will produce 750 bushels of corn. If you’re clever and ambitious, five acres will feed your family. 2,000 square feet X $4. 2022 Foundation S Build Concrete Basement Calculator. For our example, the final land value and max offer price would be $215,000 ($305,000 — 90,000 = $215,000). Square Feet. The UDS can be calculated by multiplying the total land area with the size of the individual apartment (3,500*1,000) in this case and dividing the result by the sum of areas of all apartments which is 1,000*5=5,000. How many square feet will 25 tons of gravel cover? Using 2 inches for the depth, the following measurements are a guide to the amount of gravel coverage per How Much Does A Yard Cover? A cubic yard of material can be spread to cover 100 square feet (10×10 foot area) at 3 inches of depth. For instance, if. Our data comes from trusted sources such as HM Land Registry, Royal Mail, Ordnance Survey, and Registers of Scotland. Square meter can be abbreviated to m2 or sometimes to sq m. Calculate square feet, meters, yards and acres for flooring, carpet, or tiling projects. It’s also 1/640 of a square mile. This way it is much more difficult for the writer to «game the system» by using large fonts and excessive spacing to Is this really something that’s worth complaining about? The important issue is to write the best The best way to know your per page word count would be to look at past pages and count the. Round (decimal places): 1 2 3 4 5. One square foot equals 144 square inches. Put that kitchen in a house that’s 2,000 square feet. how much for a 250 square foot wood deck. 0 m2), so simply multiply that area by the number of doors you plan to paint. Price Per Square Foot How To Figure Home Values This comparison can be based on averages Unique Decor Apartment Renovation Cost Per Square Foot Will the home be within your budget? Here S How Much It Costs To Renovate Each Room In Your Home Business Insider The cost for a. Does the maximum of 15 daily irrigations include those we do on our own plants?. Land Surveyors cost: $400-$1,000. For the average 1,500-square-foot home built before the 1960s, that comes to about $223 per square foot. Cost per Square Foot Calculator. this would put the price-per-acre in this region of the. Use the square footage calculator to work out an area of square feet, square meters or square yards for flooring, landscaping, carpets, tiling or construction projects. The visualization above focuses in on price per square foot at the county-level Across the river in Brooklyn (Kings County), the second most costly area of NYC, the price per square foot is only about a Lastly, it is worth noting that Pitkin County in Colorado is one of the other three most expensive. Different aspects of building a custom home are going to cut more into the overall budget. Cost per Square Foot to Build a Custom Home In comparison, the price for building a custom home can be as high as $550 per square foot, depending on what you want. Real Estate. The United States cropland value averaged $4,100 per acre, no change from the previous year. Not sure how much marijuana to grow? This blog will help you figure out the right number of cannabis plants to fit in each square metre of your grow space. We give you the cost of painting a house per square foot India in 2021. Therefore, if you have a 600 square foot garage roof you actually need 6 squares. Details: There can be cheaper land in some locations with an average cost of around $1,000-$5,000 per acre, and these. Landscaping costs vary depending on the size of the job and When professionally installed, costs can run close to $10 per square foot, but having a professional plan out your land use could cost as little as a few. 40% of 70% = 28%. Therefore, the average per square foot cost is about $192—the total divided by the five properties. Calculator Plants Per Square Foot images that posted in this website was uploaded by Mikebochoffband. metre and 5. remarkably the project has an impressive resale value 【Get Price】. » «Value in exchange is the more significant of the two. There is no way to determine what this cost will be without doing some. 86 square meters, 0. The result is then ranked to create four divisions (quartiles) of lowest to highest cost per square foot. is $122 per square foot of floor space, according to Statistica. 00 per square foot annually. However, it’s important to corroborate information to be sure it’s accurate. The added square footage is approximately 350 sf with another 150 sf of renovated space (finishes only) and the construction cost is nearly $90,000 or about $180 per square foot. The price per square foot would be $100. Includes: comparing composite deck prices per Learn more about how much a composite deck costs from in our Straight The Baker’s Family built a One of our customers in Chester county wanted about $1600. Hardie Board siding costs $7 to 13 per square foot installed. Calculate square footage, square meters, square yardage and acres for home or construction project. What does it equate to when it comes to meters, yards, or hectares? When it comes to a square mile, you will be able to fit 640 acres of land in it. But that can vary widely based on where you live and other factors. Once you have a ballpark estimate of how much you’ll be spending. How To Calculate Square Feet Real Estate! real estate listing While the 1,000 square foot finished basement in your home might not be worth as much, the 950 square Price Per Square Foot: How To Figure Home Values. Rental rates measure the value of using land for agricultural production. Here’s an insider secret to consider: the last square foot is the cheapest square foot. Average costs and comments from CostHelper’s team of professional journalists and community of users. Average costs for installation run from $6 to $9 per square foot. According to the latest estimates, the median price for each square foot for a home in the United States is $123. Of this area, 6,423 square miles (58. An experienced land appraiser explains how he investigates a property to understand what makes it valuable and what detracts from its value. For instance. I bought a part of a neighbours garden 5 years ago — 67feet long by 19 feet wide — roughly half of the neighbours garden attached to a 2 bed terrace. Example: A parcel of land contains 180,000 square feet with a road frontage of 800 feet, and recently sold for $80,000. Morning Folks!! The real estate market is based on a square foot price. The most common way to express the value of an acre is through square feet. Total Cost. Just type the number of square feet into the box and the conversion will be performed automatically. I calculated the square footage of the property. How Much Does Fiber Cement Siding Cost? — HomeAdvisor. Houses of similar age, square footage and land size. 9 million square feet. 8 percent) is land, while the remaining 4,509 square miles (41. Establish your max offer price. Cropland rental rates increased the most in the Southeast (up 5. Under ideal conditions, you can graze 5 cows and their calves on it. For the property cited in the example, I would. Square foot pricing can be a shifty concept that doesn’t always mean what you might think it does. The price per square foot of the larger home is $92. It is the size of a square that is one foot on a side. It covers a total of 18. One square meter is equal to 1550 square inches or 10. Now put that kitchen in a house that’s 4,000 square feet. 56 per square foot*. This is called «extraction. 21 Jan 2019 200 square feet isn’t a lot to work with — but one New Yorker has of homes of all sizes and styles built on budgets big and small, to show It’s hard to get a rough picture of how much space a certain number of square feet takes up. 2 day ago You can arrive at the «average» per-square-foot cost. Calculate project cost based on price per square foot, square yard or. Convert square feet to acres by dividing the number of square feet by 43,560 (e. How Much Does It To Finish A Basement Bankrate. Here’s a loose outline from HomeGuide that shows how much of the budget different factors can cost. In SI units a square foot is 0.

pgv pbu ynh vyi bee csw qkw rfn crw ehn tiy nuz xeu btc ogd lzt ztm zwe ijf rqy

гитар с росписью Пикассо… и несколько быков. — 99 Решений

В 1945 году Пабло Пикассо создал свою работу « Бык » — набор из одиннадцати отдельных литографий, которые красноречиво превращают полностью реализованный образ быка в минималистическую визуализацию.

Я лично видел это в музее Нортона Саймона в Пасадене, Калифорния, где находятся работы. Когда я проходил мимо каждого из рисунков на выставке, меня завораживало то, как он вызывал эту трансмутацию от явного к абстрактному.

Когда я преподаю музыку, я использую «Быка» Пикассо как наглядную аналогию ко многим вещам. Одна аналогия включает в себя преобразование гаммы в настоящую музыку.

Как педагог по игре на гитаре, я хорошо знаком с часто задаваемым вопросом…
«Как сделать так, чтобы гаммы звучали круто?»

Очень хороший вопрос.

---

Давайте начнем с того, чтобы убедиться, что вы понимаете, что такое лад и рисунок лада на гитаре.

Шкала  – это группа нот, которые ухо/мозг воспринимает как имеющие определенное «качество»… мажор, минор, радость, грусть, блюз и т. д., и одна из заметок становится «руководителем команды», что означает, что эта заметка звучит как «домашняя база» для ваших ушей. Эта нота «домашней базы» является ключом этой гаммы.

Хорошо, по общему признанию, это не самое академическое объяснение, однако оно объясняет это наиболее простым и не слишком техническим или теоретическим образом.
Если вы ничего из этого не понимаете, я предлагаю вам провести небольшое исследование в Интернете и добраться до места, где вы действительно понимаете концепцию музыкальной гаммы. Или вы можете написать мне по электронной почте, и я буду рад разработать для вас лично от моего мозга до вашего.

Далее, вы должны понимать, что шкала на гитаре представляет собой все ноты этой гаммы, достижимые в данной позиции.
Убедитесь, что вы правильно понимаете это утверждение…

Образец гаммы на гитаре представляет собой все ноты этой гаммы, достижимые в данной позиции.

---

Давайте остановим автобус на минутку и убедимся, что вы понимаете термины «позиция» и «доступность»

Позиция — это особый гитарный термин, обозначающий положение вашей руки на грифе.Он определяется как независимо от того, какой номер лада находится на первом пальце. Затем второй, третий и четвертый пальцы на последующих ладах. Так, например, в пятой позиции ваш первый палец находится на пятом ладу, и это относится ко всем шести струнам. На этой диаграмме наглядно показаны все ноты, до которых можно удобно дотянуться на 5-й позиции…

 

 

 

В идеальном мире ваши четыре пальца всегда были бы на одной линии на четырех последующих ладах. Однако это , а не идеальный мир, поэтому термин позиция используется, даже если ваши остальные пальцы раздвинуты на столько ладов, сколько вы можете дотянуться.

Следующий пример находится на 7-й позиции, но остальные пальцы вытянуты. Это не какая-то шкала, это просто пример вытягивания пальцев, оставаясь при этом в определенном положении.

 

 

 

Главное здесь заключается в том, что, поскольку вы никогда не сможете дотянуться до всего грифа сразу, вы должны помнить об эргономичном подходе к грифу … четыре лада, плюс-минус лад .
(для кого-то может быть больше ладов, но сейчас мы говорим о типичных людях, играющих типичные гаммы)

Таким образом, ладовая гамма – это массив нот этой гаммы, до которых можно дотянуться рукой в ​​заданной позиции.

Если вы хотите играть на гитаре познавательно, т. е. изучать и практиковать гаммы, очень важно мыслить с точки зрения позиций.

---

Еще раз говорю вам…

Рисунок гаммы на гитаре представляет собой все ноты этой гаммы, доступные в данной позиции.

Итак, вот вездесущий Минорная пентатоника паттерн в тональности G…

 

 

 

Если вы художник, вы хотели бы, чтобы все ваши краски разных цветов и все ваши разные виды кистей были рядом с вами, чтобы вы могли сразу достать их, когда рисуете свое искусство.
Это очень мешает творческому потоку, если вам приходится останавливать то, что вы делаете, и идти в другую комнату, искать то, что вам нужно, а затем возвращаться к тому, что вы делаете.

Посмотрите на мистера П!… ему не нужно двигаться больше, чем на несколько футов, чтобы добраться до всего, что ему нужно, чтобы нарисовать этих абстрактных гетаров и быков.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таким же образом ладовая гамма предоставляет все ноты этой гаммы прямо под кончиками ваших пальцев, в заданной позиции. Это очень удобно для тебя, музыкальный артист.

Но есть еще один важный вопрос, о котором мы упоминали ранее…

Что вы делаете со всеми этими нотами гаммы, чтобы они звучали круто ?

Ответ: Все, что хотите!

Но этот ответ основан на бесконечности, и люди склонны замыкаться в своих мозгах, когда у них есть все варианты в мире.
(Быстро… какое у вас самое любимое гитарное соло? Ваша любимая группа? Ваш любимый фильм?)

---

Позвольте мне провести вас через процесс, который проведет вас от скучной старой сварливой кошачьей гаммы к супер-крутому гитарному соло.
Но сначала еще одна аналогия с искусством…

Существует часто цитируемая поговорка о том, что скульптор, когда его спросили, как он создал прекрасную статую богини, ответил: «Я просто высек все, что не является богиней!»
(существует множество вариаций этой цитаты и ее происхождения)

Итак, вот вы смотрите на свой большой кусок мрамора, задаваясь вопросом, как вырезать из него богиню гитарного риффа…

 

 

 

Начнем с создания простого риффа.
(или лизание, или фраза , или мотив… это общеупотребительное слово для всех, знаете ли)

Я уберу некоторые записи и просто поработаю с ними…

 

 

 

Давайте добавим отрыв между двумя нотами на второй струне…
(здесь мы собираемся переключиться на TAB)

 

 

 

Круто, но могло быть и круче.
Как насчет бенда на 3-й струне на 5-м ладу?…
(цифра 1 в верхней части стрелки означает бенд на один тон)

 

 

 

Затем выберите 2-ю струну, 3-й лад… затем 3-ю струну, 5-й лад… затем 3-ю струну, 3-й лад…

 

 

 

И закончим пулл-оффом и слайдом с нотами на 4-й струне…

 

 

 

Все вместе выглядит так…

 

 

 

Переход вперед и назад между воспроизведением всей гаммы и воспроизведением фразы. Следите за левой рукой во время игры.

Поздравляем!
Вы взяли сухую стерильную чешуйку и превратили в крутую модную музыкальную фразу.

Теперь все, что вам нужно сделать, это повторять этот процесс много-много раз с каждой известной вам гаммой на всю оставшуюся жизнь.

(кстати, вы можете записать свои фразы в табуляции или нотной записи)

---

Художественный процесс — это увлекательное исследование. Существует постоянная дихотомия свободного течения аноэзисного подхода и старого доброго подхода «раскрашивания по номерам»… также известного как познание.То, что мы сделали здесь, в этой статье, конечно, больше относится ко второму, но это та практика, которая необходима, чтобы показать вашему разуму и телу, как работает этот процесс. Создавая искусство в контролируемом и вневременном состоянии, вы в конечном итоге сможете свободно творить в данный момент. (Вы видите, что я там сделал? Я дал ссылки на определения. Не нужно меня благодарить… правда. )

Пикассо, казалось, заморозил творческий процесс.
И он наверняка нарисовал много гитар, учитывая, что на самом деле он на гитаре не играл… по крайней мере, согласно моим исследованиям в Интернете.

Это просто показывает, насколько круты гитары.
Все хотят быть гитаристами… но если не умеешь играть, нарисуй.

Как сделать гриф для гитары

Как добраться до грифа  

Этот раздел посвящен изготовлению накладок на гриф для искусно сделанных гитар.

Ниже показана накладка на гриф из бразильского палисандра в скиммере, сплющенная и доведенная до окончательной толщины.Вот та же доска, на которой прорезаются лады на настольной пиле с помощью приспособления для прорезки ладов. Вот грифы с прорезями, обрезанные по размеру и склеенные. Методы связывания будут рассмотрены в разделе построения шеи. Эти доски готовы к инкрустации. Материалы для инкрустации (в данном случае бивень мамонта и швабра) сглажены и готовы к резке. Вот снимок заготовок инкрустации из бивня мамонта, приклеенных к разделочной доске, вместе с держателем приспособления и приспособлением для резки алмазной инкрустации. Вот он с собранным приспособлением, все готово к работе.Разделочная доска фиксируется в держателе с помощью штифтов, а шаблон из плексигласа привинчивается к держателю. Вот роутер крупным планом. Здесь вы можете увидеть цангу 3/16″, которая будет перемещаться по краям режущего приспособления, создавая вставки. Также обратите внимание на 2 вакуумных порта и порт вентилятора. Порт воздуходувки присоединяется с помощью хирургической трубки к воздуходувке аквариумного типа.

Этот мягкий поток воздуха дует прямо в цангу, предохраняя цангу от засорения вязкой пылью из палисандра, а также действует как охлаждающая жидкость, продлевая срок службы биты и обеспечивая более чистые результаты.Вакуумные порты присоединяются с помощью хирургических трубок к вакууму. Это, очевидно, для удаления пыли из очень ограниченного пространства, отлично работает. Неожиданным бонусом здесь стало то, что вакуумные порты также работают как фиксатор для маршрутизатора. Я могу отпустить маршрутизатор в любое время во время маршрутизации на полной скорости, и маршрутизатор остановится и остановится без каких-либо побочных эффектов. Эффект удержания также стабилизирует маршрутизатор во время трассировки, обеспечивая более стабильные результаты.

Режущие вставки для деревообработки

Вот часть первого прохода.Первый проход выполняется с долотом 0,040″. Вот он после второго прохода. Второй проход выполняется с битом .045″ в качестве очищающего прохода. Это сверло с 4 канавками, режущее всего 0,0025″ и оставляющее удивительно чистый край для ручного инструмента. Ниже показан крупный план инкрустации 12-го лада, как демонстрация этого.

Здесь вырезаются трапециевидные вставки для сертифицированного 7. Та же процедура здесь, но с немного меньшей скоростью подачи материала оболочки, что намного сложнее. Резка завершена. Вот тот же приспособление, которое использовалось для вырезания деталей инкрустации с накладкой из бразильского палисандра, с двух сторон приклеенной скотчем к рабочей доске из плексигласа, которая устанавливается с помощью тех же штифтов, готовая к вырезанию карманов для деталей вставки. Я использую тот же шаблон и те же головки и фрезы для выполнения карманов. Разница здесь в том, что мне нужно привести путь фрезы к ширине сверла. Если я этого не сделаю, вкладыш будет плавать в кармане. Это достигается с помощью вторичной цанги, которая надевается на первичную цангу, прикрепленную к основанию фрезера.На фото ниже вы можете видеть вторичную цангу, изготовленную из бронзы. Я сделал несколько таких вторичных цанг с шагом 0,001″. Некоторые виды по-разному реагируют на резку из-за различий в плотности и зернистости. Вы будете удивлены, какая разница в несколько тысячных. Часть пути через первый проход. Второй проход снова выполняется сверлом 0,045″, которое разрезает только 0,0025″ материала, оставляя невероятно чистый край кармана. Когда края карманов обрезаны, я переключаюсь на другую настройку фрезера, чтобы удалить оставшийся материал.Этот фрезер оснащен битой 1/8″ и цангой большего размера. Это экономит время и предотвращает поломку или затупление небольших фрез. Вот карманы все разорваны. Вот несколько снимков накладки грифа из мадагаскарского палисандра, подвергшейся такой же обработке с бриллиантовыми вставками из бивня мамонта. Вот они после обработки карманов.

Этот метод оставляет мне немного ручной работы, чтобы заточить закругленные углы, оставленные радиусом резака. Я делаю это либо крошечным долотом, либо модифицированным ножом x-acto.Ниже представлены снимки ромба на 12-м ладу и трапециевидной вставки на 5-м ладу до и после. Вот много. Фрезерован, углы зачищены и готовы к инкрустации. Вот пример того, насколько точна эта система. Вкладыш установлен, плотная посадка при легком надавливании большим пальцем. Это инкрустация 7-го лада.

Вот несколько снимков изготовленной на заказ инкрустации 12-го лада из шоколадной кости мамонта. Этот дизайн слишком сложен, чтобы использовать описанную выше систему шаблонов и резаков, поэтому здесь мы возвращаемся к старой школе.Методы, использованные здесь, будут описаны при вставке логотипа грифа в разделе построения грифа. Вот лот, инкрустация и установка. Доски готовы к радиусированию. Радиальное использование грифа. Вот мой радиусный зажим. Справа вы можете видеть маршрутизатор, прикрепленный к салазкам с закругленными полозьями. Эти полозья создают радиус, перемещаясь по стержням из нержавеющей стали, которые соединяют две части каретки, показанные слева. Каретка плотно прилегает прямо к держателю джига и скользит вверх и вниз по всей длине грифа.Вот и все части приспособления готовы к работе. Фрезер и салазки перемещаются назад, вперед и назад, чтобы создать радиус, а каретка перемещается справа налево по одному проходу за раз. Вот он после маршрутизации. Для этой операции я использую концевую фрезу 1/4″. Он отлично работает для этого и даже жужжит прямо сквозь жемчуг без усилий, когда биты острые. Линии, которые видны сейчас, являются не глубокими, а очень мелкими следами на поверхности, оставленными физическими особенностями концевой фрезы и тем, как она срезает волокна древесины.Они будут отшлифованы в ближайшее время с помощью шлифовального блока, показанного ниже, оснащенного наждачной бумагой с зернистостью 400. И вот оно! Вот все, все отшлифовано и готово для боковых точек. Я покупаю СС и боковые точки из морского ушка, но мне нужно сделать точки из бивня мамонта здесь, в магазине. Делается это на фрезерном станке с поворотным столом. Вот мой станок для точечного сверления сбоку. Очень простой. Просто кусок плексигласа 3/8″ с хорошо расположенными направляющими втулками. Он кладется на рабочую доску из лексана, чтобы установить правильную высоту.На приспособлении вы можете увидеть точки, все еще приклеенные к дереву подложки после операции резки. На фотографии выше вы можете видеть сверло 5/64″, используемое для сверления, а на фото ниже вы можете видеть чистые отверстия, которые производит сверло. Здесь точки вдавлены и приклеены. Накладки на гриф теперь сняты с рабочих лексановых накладок. Небольшая чистка боковых точек, и доски готовы к грифу! Рик Магуайр

⇐ Предыдущая страница        Θ        Следующая страница⇒

Введение в технологию передачи энергии флуоресцентного резонанса (FRET) и ее применение в биологических науках

 

Автор : Paul Held, Ph.D, Отдел приложений, BioTek Instruments

 

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все больше и больше используется в биомедицинских исследованиях и разработке лекарств. FRET основан на передаче энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору в зависимости от расстояния. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET — это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору.Молекула-донор — это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор — это хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул. Перенос энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни в возбужденном состоянии, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пара молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор/акцептор.

Хотя существует множество факторов, влияющих на FRET, первичных условий, которые необходимо выполнить для возникновения FRET, относительно немного. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10-100 Å). Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрываться со спектром флуоресценции донора (рис. 1). Степень, в которой они перекрываются, называется интегралом спектрального перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть приблизительно параллельны.Предполагая, что пары донор-акцептор совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Фёрстер продемонстрировал, что эффективность процесса (Е) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. уравнение 1). [1]

 

Уравнение 1. E = Ro ⁶ /(Ro ⁶ + r ⁶ )

 

Где Ro — расстояние Фёрстера, на котором передается половина энергии, а r — фактическое расстояние между донором и акцептором.Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Фёрстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояния Ферстера в диапазоне от 20 до 90 Å наиболее удобны для изучения биологических макромолекул. Эти расстояния сравнимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на многосубъединичных белках. Любой процесс, влияющий на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить этот процесс.В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), угловую ориентацию диполя каждой молекулы (k2) и интеграл спектрального перекрытия донора и акцептора (J). См. уравнение 2.

 

Уравнение 2. Ro=9,78 x 10 ³ (n ^-4 *fd*k ² *J) ^1/6 Å

 

 

 

Рис. 1.Схематическое представление интеграла спектрального перекрытия

 

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать произвольные числа для расстояния Фёрстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно установить равным 1 (Ro = 1), а расстояние между донором и акцептором также равно 1, то r = Ro, и уравнение для эффективности будет следующим: E = 1 ⁶ /(1 ⁶ + 1 ⁶ ), что равно 0.5 (т.е. 50%). Это полумаксимальное значение и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 0,1 ⁶ ) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором в 10 раз больше (т. е. r = 10Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 10 ⁶ ) = 0,0000001. Эта исключительная чувствительность к расстоянию позволяет использовать FRET для экспериментов с близостью.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению флуоресценции донора. Донорный зонд всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении их излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Очень быстро (в течение пикосекунд) эти электроны распадаются до самых низких колебательных уровней (S1) и, в конечном счете, (в течение наносекунд) распадаются обратно в состояние So, при этом испускается фотон света.Когда условия для возникновения FRET соблюдены, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за затухание энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ излучается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. Последующий возврат в основное состояние испускает фотон (рис. 2).

 

 

Рис. 2. Схематическое изображение колебательных энергетических состояний электронов, возникающих во время FRET.

Измерение

 

Обнаружение и количественный анализ FRET, безусловно, можно осуществить различными способами. Поскольку FRET может привести как к уменьшению флуоресценции донорной молекулы, так и к увеличению флуоресценции акцептора, можно провести пропорциональное определение двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что можно измерить взаимодействие, не зависящее от абсолютной концентрации сенсора.Поскольку не все акцепторные фрагменты являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средства для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к тому, что флуоресцентная донорная молекула оказывается в непосредственной близости от такой молекулы, приводят к потере сигнала. И наоборот, реакции, устраняющие близость флуоресцентного донора и гасителя, приведут к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров может быть анализ протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентную часть на одном конце и гасящую молекулу на другом конце, разделенные пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

 

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечили способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохраняют свою флуоресцентную способность. Эти красители полезны тем, что являются генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами для образования химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или родственный элемент флуоресцентного белка) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только тогда, когда пары донор/акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, возникает FRET. (Рисунок 3)

 

 

Рисунок 3. Схематическое изображение взаимодействия двух различных химер флуоресцентных белков. Взаимодействия белок-белок между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок оказываются достаточно близко друг к другу, что делает возможным возникновение FRET.В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

 

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, излучающие в красной области спектра (>550 нм), имеют ряд преимуществ. Диапазон их излучения таков, что фоновая флуоресценция часто снижается. Кроме того, можно измерять большие расстояния (> 100 Å) благодаря высоким коэффициентам экстинкции и хорошим квантовым выходам. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который максимально излучает при 570 нм, и Cy5, который излучает при 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть связаны непосредственно с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

 

 

Рисунок 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5 при отжиге меченых олигонуклеотидов.

 

В примере, изображенном на рисунке 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отжигают (рис. 4А), возбуждение олигонуклеотида РНК, меченного Cy3, светом при 540 нм приводит только к излучению света Cy3 при 590 нм, в то время как комплементарная олигонуклеотидная РНК, меченная Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам дают возможность отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет осуществить перенос FRET. Это приводит к излучению света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не вся эмиссия Cy3 при 590 нм теряется, но значительная ее часть теряется.

 

 

Рисунок 5. Схематическая диаграмма активности FRET, используемой VSP

 

Датчики напряжения

(VSP) — это технология анализа на основе переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET), используемая для обнаружения лекарств с высокой пропускной способностью ионных каналов.Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой подвижный, отрицательно заряженный, гидрофобный оксонол [DiSBAC ₂ (3) или DiSBAC ₄ (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). Именно зависимость от расстояния используется в ВСП. Только тогда, когда акцептор DISBAC ₂ (3) расположен снаружи клеточной мембраны, возможен FRET.Покоящиеся клетки имеют относительно отрицательный потенциал, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от акцепторного зонда оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксоноловый зонд быстро перемещается (в масштабе доли секунды) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксоноловый зонд «чувствует» изменения напряжения в клетке и реагирует на них.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный сигнал синей флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Деполяризация клетки, которая вызывает перемещение DISBAC ₂ (3) на внутреннюю сторону мембраны, как ожидается, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно использовались в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал/шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик.Излучение этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начинать измерения после прекращения действия возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мс) позволяет рассеять фоновую флуоресценцию органической акцепторной молекулы с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, измеряется только донорно-акцепторное излучение, когда включена соответствующая задержка.

Молекула донора не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы испускают фотоны способом, очень похожим на флуоресценцию. Основное отличие состоит в том, что электронное возбуждение является результатом не поглощения фотонов, а скорее высвобождения химической энергии, содержащейся внутри молекулы. Когда возбужденные электроны возвращаются к своей основной энергии, она может высвобождаться в виде фотона света или передаваться через RET к молекуле-акцептору, если условия правильные. Хотя количество молекул, которые можно использовать, ограничено, эта технология имеет то преимущество, что нет внешнего возбуждения молекулы-акцептора.

Проблемы

 

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема — это близость. В зависимости от дизайна анализа близость будет либо установлена, либо удалена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор/акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Возбуждающий фильтр для донора должен избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязнение прямого возбуждения акцепторной молекулы можно объяснить с помощью соответствующих контролей, но большие количества затруднят интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, сводят к минимуму возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если большое количество донорных и акцепторных молекул присутствует, но не взаимодействует, количество происходящих FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя молекулы донора и акцептора могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактической активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор/акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны быть в достаточной концентрации, чтобы произошел FRET. Большинство событий связывания представляют собой динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет, естественно, низким. Например, временные трансфекции двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не транслируется эффективно в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может играть роль.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая молекула находится в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждого из них.

Применение FRET

 

• Структура и конформация белков [3]
• Пространственное распределение и сборка белков [4]
• Взаимодействие рецептор/лиганд [5]
• Иммуноанализ [6]
• Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
• ПЦР в реальном времени и обнаружение SNP [8,9]
• Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
• Распределение и транспорт липидов [11]
• Анализы слияния мембран [12]
• Датчик мембранного потенциала [13, 14]
• Анализы флуорогенной протеазы [15]
• Индикаторы для циклического AMP [16]

Узнайте больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Ссылки

 

1. Фёрстер, Т.(1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Физ. 2:55-75.
2. Циен, Р. (1998) Энн. Обзор Biochem, 67:509-544
3. Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные соотношения свободной энергии в разворачивании репрессора Arc подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания.». Biochemistry 35:4795-4802.
4. Уотсон Б.С., Хазлетт Т.Л., Экклстон Дж.Ф., Дэвис С., Джеймсон Д.М., Джонсон А.Е. (1995) Расположение макромолекул в аминоацил-тРНК.фактор элонгации тройной комплекс Tu.GTP. Исследование переноса энергии флуоресценции. Биохимия 34:7904-7912
5. Berger W, Prinz H, Striessnig J, Kang HC, Haugland R, Glossmann H. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca(2+)-каналами L-типа, выявленный с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
6. Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4′,5′-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый акцептор переноса энергии флуоресценции с диполь-дипольной связью, полезный для иммунофлуоресцентных анализов.Анальный биохим 108:156-161.
7. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ переноса энергии флуоресцентного резонанса. Биофиз J 66:99-109.
8. Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Воуденберг ТМ. (1999) Семицветное гомогенное обнаружение шести продуктов ПЦР. Biotechniques 27:342-349.
9. Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфичной ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Геном рез. 11:163-169.
10. Паркхерст К.М., Паркхерст Л.Дж. (1995)Кинетические исследования переноса энергии флуоресцентного резонанса с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с олигонуклеотидным комплементом и с одноцепочечной ДНК. Биохимия 34:285-292.
11. Николс Дж.В., Пагано Р.Э. (1983) Резонансный анализ переноса энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258:5368-5371.
12. Uster PS (1993) In situ резонансная микроскопия переноса энергии: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221:239-246.
13. Хоффман, Р. и Хелд, П. Примечание по применению BioTek.
14. Гонсалес Дж.Э., Циен Р.Ю. (1995)Определение напряжения с помощью переноса энергии флуоресцентного резонанса в одиночных клетках. Биофиз J 69: 1272-1280.
15. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз методом резонансного переноса энергии. Science 247, 954-958.
16. . Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического АМФ, флуоресцентные и люминесцентные зонды для биологической активности, Mason WT, Ed.стр. 133-149.

 

Чудо-салфетка Stewmac. Каждая ножка склеена из восьми полос по 3 х 2 толщиной в каждой на общую толщину V4. Он даже издает царапающий звук, когда я применяю вибрато. В конце концов, вы можете использовать любую ткань, если она впитывающая и не слишком грубая на ощупь. Получите его уже в среду, 17 ноября. Силикон очень вреден для гитар Martin — вам не следует его использовать. Н. Игрушки для малышей; Развивающие детские игрушки; Книга для рисования водой для малышей, тканевая книга с ручкой, многоразовое обучение; Baby Water Drawing Painting Cloth Book Learnin Trend ранг Ecopost Eco250 Картридж с чернилами, совместимый с Hasler WJ250 — полный товар HaslRegión.У меня хорошая сделка, и мне нравится мандо, но я хотел бы, чтобы эта проблема исчезла. Дино Вельвет Старший член. Волшебное устройство. Его также можно использовать для тренажеров с подвесными ремнями, олимпийских гимнастических колец, воздушных качелей, терапевтических качелей, качелей для аутистов, гамаков, эспандеров и других силовых тренировок по кросс-фиту / йоге / весу тела. 17 октября 2005 г. не должно быть необходимо на финише, так что не делайте этого. (5) От 6 долларов. StewMAX БЕСПЛАТНАЯ доставка! Инструменты для мастеров + расходные материалы. Ответ (1 из 3): этот вопрос задается от имени человека, у которого есть проблема, который не хочет, чтобы его имя или вопрос был задан.com Реакции: Fumblefinger, Rocco Crocco и SWEAT hog. Я никогда не видел более безрассудного решения по очистке ладов без заботы о звукоснимателях, притягивающих стальную вату. Ознакомьтесь с нашей картой сайта, чтобы получить обзор каждого раздела. Купальники, шорты и похудение. Повторите на следующий день. Я использую микросетку при первой смене струны. Присоединился 25 апреля, … Miracle Cloth — это универсальное средство для чистки и полировки, которое полностью выдержало испытание временем. 62 Очиститель гитарных струн, очиститель грифа гитары, салфетка для чистки латунных струн для гитары, скребок для чистки гитары гитары для бас-мандолины укулеле (CS 01) 4.Факт, который я обнаружил недавно. 2007-02-16T23:28. com Rock Miracle Safer Strippers не едкие, негорючие, не содержат метиленхлорида, щелочей или метанола и являются гораздо лучшей и более безопасной альтернативой, когда на карту поставлены вопросы безопасности и защиты окружающей среды. Кроме того, я чищу гриф только в том случае, если он нуждается в чистке, а не протираю его чистой сухой тканью. Не беспокойтесь, если вы немного нажмете на лады, но в целом старайтесь их избегать. Настоящее здание было начато в 1388 году. #1. Симпатичный уникальный белый усилитель; Черный штат Небраска PACJ1313 PopSock.Miracle Cloth чистит, полирует и натирает воском все в доме или магазине. Автор: Midlifecrisis71, 5 января 2022 г., обсуждение в разделе «Другие крутые гитары». Чтобы ножки не прогибались под большими нагрузками (например, зимнее пальто), я решил сделать их шириной 1 фут. Все дело в краске «Wood Whisperer Style». Посмотреть все инструменты Luthier + расходные материалы Салфетка для полировки Miracle (10) $7. Первым делом нарезаем полоски для ножек. Трамп заразился COVID19, потому что не слушал науку. С любым из них вы должны заклеить гриф малярным скотчем, чтобы не оставить следов или мелких царапин на дереве.Изменить — я нашел его с помощью простого поиска в Google. Реакции: 2 человека. С моим влечением к Green Instruments я увидел картинку и просто ДОЛЖЕН был . Набор из 20 ладов StewMac Pre-Cut Medium (23) от 17 долларов. Чудо-салфетка Starfiber доступна в двух размерах: один для использования на твердых поверхностях, а другой — для ковров. Он также является разработчиком инструментов и аксессуаров для изготовления и ремонта гитар, которые сегодня используются производителями музыкальных инструментов по всему миру. StewMac Compact Chisel Planes, Набор из 3 Ответить Отчет 2 3 года назад.Просто снимите ручку управления и завинтите колпачок для очистки кастрюли из нержавеющей стали. Слоя вообще не должно быть много, как будто там ничего и не было, но такой гладкий и достаточно водостойкий. Потенциальная проблема возникает, когда тонкий слой между двумя частями слишком толстый, «гвозди» могут сломаться, и соединение станет неэффективным. Кросс-лейнс, Западная Виргиния. Вечные звукосниматели, регуляторы скорости EVH для увеличения тона и громкости, а также перевернутые контрольные пластины согласно Биллу Кирчену. Что я хочу попробовать, так это ластики StewMac для ладов STEWMAC.Сумка для батареек, губка для хлеба Serany или набор файлов Экономия денег. Товары (276) 276 результатов. Шон. — 3 ткани Miracle размером 6×9 стоят 20 долларов плюс высокая стоимость доставки. 25. Горгомит и чудо-ткань входят в число продуктов, которые я бы никогда не использовал. Д для меня. Scratchy Pot + набор для чистки переключателей. Такое ощущение, что струна перетирает лады. Разместите фото или бренд, чтобы мы могли видеть его. 15 долларов. Салфетка для полировки Miracle — StewMac Очистите и придайте блеск ладам и накладкам грифа. Дружелюбное обслуживание клиентов ï¼ Если у вас есть какие-либо вопросы или проблемы с вашим продуктом, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам, мы ответим как можно скорее и разберемся с ним. проходит до тех пор, пока не перестанет впитываться.Я чувствую там сопротивление. . Но какое это было путешествие. Toastfields — ваш универсальный магазин, если вы ищете замечательные находки в Интернете. мензура 5″, 1 шт. падук, лады из нержавеющей стали ss6105, ширина порожка 1 5/8″. Покупайте полировальные и абразивные инструменты для фреттинга в StewMac. 1111 19TH AVE E SUPERIOR, WI 54880 Проложить маршрут (715) 398-5225. Всегда сначала используйте формулу Nature’s Miracle No More Spraying Stain and Odour Remover. Эта фотография была опубликована официальным корейским центральным информационным агентством Северной Кореи 10 сентября.Я даже использовал этот трюк на своем старом баннере 1942 года. 60% хлопок, 40% полиэстер Импортная застежка на пуговицах Машинная стирка Хлопковая смесь Пике 50 Протестировано на усадку при стирке amp; Хаос, устойчивый к выцветанию, разразился в нигерийской деревне, когда таинственный отрезок ткани упал с неба на общину, и жители боролись за куски материала, в который, как они верили… Scale Microfiber Polishing Cleaning Cloth, многоразовое безворсовое впитывающее полотенце онлайн от Wayfair, мы максимально упростили для вас возможность узнать, когда ваш продукт будет доставлен.Он увидел в нем что-то, что ему понравилось. Замените свои бумажные полотенца на эту европейскую технологию микрофибры премиум-класса, подходящую для домашних животных, детей и не содержащую химикатов. В звучании Mister-O есть что-то непринужденно классическое. Собор был основан королем Астурии Фруэлой I в 781 году нашей эры и расширен в 802 году. 168. 3 из 5 звезд. Удаляет плохую коррозию с металлов. 60 $4. Салфетка для полировки профессионального размера Чистый хлопок Сделано в США для золотых, серебряных и платиновых ювелирных изделий, часовых монет Нетоксичное средство для удаления потускнения Большая чистящая ткань 11 x 14 дюймов Сохраняет чистоту и блеск ювелирных изделий Универсальная ткань для полировки 9 x 12 Революционная ткань для полировки, которая заменяет и выполняет полную полку жидких, пастообразных и порошковых чистящих средств.15 ноября 2021 г. Еще лучше — просто регулярно протирайте гитару влажной хлопчатобумажной тканью. 99 ($1. Пусть сохнет Внутри подарочной упаковки: шкатулка для драгоценностей, подарочный мешочек, мягкий бархатный мешочек, серебряная ткань для серебряных украшений, рукописные открытки и конверты и колье на тематической открытке. Сделано в США, хрусталь Clear, High Clarity, 0. $ 6. Они делают все, что мне нужно. В упаковке 3. С 1965 года Miracle Cloth заменяет целую полку с жидкими чистящими полиролями. com. Итак, помимо свободного времени, календарь шел по… Что мне не нравится, так это а) остатки, которые он оставляет на грифе (и на ваших пальцах, когда вы играете), если вы не выполняете воинственную работу по полировке, и б) доплата за Gorgomyte, когда он только что переупаковал Miracle Cloth.Сохраненные результаты поиска Рубашка поло из пике с длинными рукавами для мальчиков French Toast Boys. Информация о бизнесе. Сокрытия. Удалите лишнее, если оно есть. Гайка «пуля» 70-х годов была гораздо лучшей идеей — это все еще 1/8-дюймовая головка для ключа, но если она повреждена, вы можете довольно легко снять гайку. Чудо очистки горшка! — Premier Guitar top www. alibaba. пятна ржавчины от ванн, умывальников и т. д. jpmcwjr Модератор. Пусть вылечит После того, как я сниму струны, я сначала почищу лады. Прозрачные защитные пленки Tuff Protect для Simrad NSS7 evo2 7″ Fis.Чтобы распарить дефект, смочите участок и положите мокрую тряпку только на то место, которое собираетесь распаривать. Эти салфетки также продаются отдельно или в комплекте. Соборная базилика Святого Спасителя или собор Сан-Сальвадор в Овьедо. 00 из 5 на основе оценки 1 покупателя. Это демонстрация стандартного Fender American Standard Tele до и после, показывающая, какую разницу могут иметь бридж-пластина и комплект седла для гитары. Благодаря специальной резьбе со скошенной кромкой вы можете прикрепить крышку к самой короткой из доступных резьб на четверти оборота.60% хлопок, 40% полиэстер Импортная застежка на пуговицах Машинная стирка Хлопковая смесь Пике 50 Протестировано на усадку при стирке amp; Устойчив к выцветанию. 99. Затем, после высыхания (почти мгновенно в сухом воздухе Монтаны), я распыляю немного воска на ткань из микрофибры и использую ее для нанесения воска на шею. Работает отлично и не снимает большую часть материала. 1. Накиньте чехол на диван и натяните ткань на подлокотники. Просто промойте тряпку под теплой водой и выжмите ее для использования на: окнах, зеркалах, стекле, нержавеющей стали, окрашенном дереве, обработанной древесине, пластике, хроме, стеклянной посуде, хрустале, стерлинговом серебре, столовых приборах, amp; Китайская бытовая техника Столешницы amp; Шкафы Плитка, … Vision Care ; Поставка инструментов для чистки очков; Узнать больше Чудесная очистка очков; Салфетка для очистки очков Miracle Статические безворсовые линзы Солнцезащитные очки; Miracle Eyeglass Cleaner Макс. СКИДКА 57% Ткань Статические линзы Без ворса для солнцезащитных очков $3 Чудо-очиститель для очков Салфетка от статического электричества Линзы без ворса Солнцезащитные очки Health Beauty Vision Care Средства для чистки очков Поставки Подробнее Miracle … Ecopost Eco250 Картридж с чернилами, совместимый с Hasler WJ250 — HaslRegión full item.Еще лучше почистить какой-нибудь лад и опубликовать это, если можете/хотите/можете. COM: Ластики для ладов. Возьмите немного лака для ногтей того же цвета и аккуратно капните его в вмятину. Видимых повреждений от воды нет, это … 16.02.2007 #2. Найдите шикарные стили для похудения. Пока ручки на водной основе, вы не можете повредить. Я мог бы попробовать волшебную ткань, звучит хорошо и избавит от необходимости счищать полировальный состав, который просочился через шаблон лада на доску! Даже используя его таким образом, немного жидкости все еще выдавливается из ткани Gorgomyte на гриф (достаточно часто, чтобы немного почистить его), которую я сразу же вытираю чистой тканью.Джон Браун Джон Браун из гитарной фабрики Брауна является изобретателем бас-гитары Fretted/Less. премьергитара. Удаляет следы от пяток с плитки. Вам понадобится всего лишь небольшая капля на чистую ткань. Прочтите отзывы покупателей и распространенные вопросы и ответы о mingbaoge Деталь №: … Базовый набор для настройки гитары StewMac . ; TCMT16T304(TCMT32. Ткань синель, например, является тканью, которая также обладает высокой впитывающей способностью и имеет другую текстуру, довольно мягкую на ощупь. com Реакции: ofafeather. Клуб владельцев Martin.Используйте его для очистки инструмента, а затем сухой тканью — серьезно, вот и все! Большая ткань размером 6 x 9 дюймов… Покупайте чистящие средства и смазки для гитар в StewMac. Как уже упоминалось, не ожидайте многого. 99. Вы можете получить их в stewmac. 1 ПЕНДЖАБ ТКАНИ ХАУС ЛТД. 62 49 долларов. Крышка для очистки потенциометра предназначена для работы с потенциометрами и переключателями марки CTS с резьбой 3/8 x 32. Дайте высохнуть Чудо-салфетка Starfiber доступна в двух размерах: один для использования на твердых поверхностях, а другой — для ковров. Женщины ; Одежда; Распродажа! Модная женская винтажная повязка на талии с длинными рукавами; Распродажа за 9 долларов! Мода Женщины Винтаж С длинными рукавами на талии Назад … Нанесите мягкой тряпкой или бумажным полотенцем и проведите двумя или тремя обильными движениями, пока средство не перестанет впитываться.На спиртовой основе покрытие расплавится. — 1 лист ткани Miracle размером 6×9 составляет 9 долларов США плюс высокая стоимость доставки. К счастью, пятно высохло немного светлее и приобрело примерно тот оттенок, на который я надеялся. Редактировать: с защитой ладов я могу тереть лады, прикладывая большое усилие, не беспокоясь о том, что кончики плоскогубцев повредят дерево. Новый. com Реакции: Роберт Херндон, aon и RVA. 9 октября 2019 г. — Оставаясь верным своему лозунгу, отлично справляются со своей задачей, и мне буквально десятилетиями не приходилось маскировать гриф.Google: универсальное металлическое чистящее полотенце Miracle Cloth. Я только что взял/унаследовал проектную гитару. Он владеет и управляет полным заводом по производству и ремонту/восстановлению гитар, в котором работает команда талантливых мастеров. Стили полного покрытия Флисовая ткань также используется в качестве альтернативного материала в ткани для детской отрыжки, поэтому вы можете подумать о том, чтобы найти ткань с этой тканью. Мы приносим обзоры и предложения по продуктам, и наша цель в основном состоит в том, чтобы предоставить популярные бренды … Освещение предпродажной торговли, включая информацию о фьючерсах на S&P 500, Nasdaq Composite и Dow Jones Industrial Average.Горячие монокини с вырезами и многое другое. Отлично работает, но немного дороговато. Может быть, немного более коричневым, чем золотистый, но это нормально — важно то, что он все еще выглядит как клен,… Flykee Baby Герметичные подгузники Покрывающая ткань Один размер Регулируемый W Ответить Отчет 3 1 год назад. 2 из 5 звезд. Я использую ластик для ладов с зернистостью 8000 на всех ладах. Легко чистить с помощью обычного мыла и воды. Яркие цвета, соответствующие детской игровой комнате.Чтобы использовать тряпки, вам понадобится мыло. Сессия парламента Кореи. Запчасти и аксессуары для гитар. Вернитесь и добавьте легкое пальто и отполируйте тканью до блеска. 60% хлопок, 40% полиэстер Импортная застежка на пуговицах Машинная стирка Хлопковая смесь Пике 50 Протестировано на усадку при стирке amp; Набор StewMac Rough Fret Smooth + Shine, устойчивый к выцветанию, для обработки и полировки ладов, полировки царапин в отделке и накладке 4. Встряхните перед использованием. Ручной электроинструмент ; Аксессуары для электроинструментов; KAIFNT K702 Органайзер для шестигранных бит с магнитным основанием, бита 1/4 дюйма a; KAIFNT K702 Шестигранный органайзер для бит с 4-дюймовым 1 магнитным основанием a Mojo Hand FX Mister-O более чем напоминает оригинальный Maestro PS-1.Купил себе новую гитару, трибьют G&L asat, так как получил большую скидку на один из последних болотных ясеней перед тем, как они отправятся в Сассафрас, который, вероятно, из того же дерева. Он скончался пару лет назад, не имея возможности поработать на гитаре. Узнайте больше о нашей Политике конфиденциальности и использования файлов cookie. 91 Салфетка для полировки Miracle (10) 7 долларов. Даже используя его таким образом, немного жидкости все еще выдавливается из ткани Gorgomyte на гриф (достаточно часто, чтобы немного почистить его), которую я сразу же вытираю чистой тканью.Фланелевой тряпкой просто протрите ее очень влажной и вотрите, подождите немного, затем вытрите все. Полировальные круги с 24 ладами (41) От 5 долларов. Салфетка для полировки L Miracle. Мы обсудим различные виды красителей, как их применять Кухня столовая; посуда; Кастрюли с антипригарным покрытием в корейском стиле, эмалированные кастрюли, кастрюли для молока; Корейский стиль Кастрюли с антипригарным покрытием Кастрюли Кастрюли Кастрюли Албукерке Молл Эмаль Молоко $70 Чудо-салфетка Starfiber доступна в двух размерах: один для использования на твердых поверхностях, а другой для ковров.9% бактерий с поверхностей. 24. Это не из-за того, что все ведьмы проклинали его в твиттере (хотя большое спасибо за это, это сделало мой день). тушеное мясо. Нанесите мягкой тряпкой или бумажным полотенцем и проведите двумя или тремя обильными движениями, пока он не перестанет впитываться. Для незавершенных участков я бы попробовал старую добрую нафту. Если вы хотите использовать что-нибудь, попробуйте Petros или Virtuoso. Палисандр содержит натуральные масла, препятствующие проникновению жидкостей. Не беспокойтесь, если вы немного нажмете на лады, но в целом старайтесь их избегать.80. 010 «Правило «li» StewMac — это профессиональный подход. Обоюдоострый с заменой технических характеристик седла из Glendale American Standard бридж-пластина и комплект седла Twang. Товары 1–32 из 745 — конструкция из клена и накладка на гриф из черного дерева. с 22 ладами. Экологически чистый способ мыть окна, зеркала, нержавеющую сталь, очки и многое другое! Stewart-MacDonald онлайн и делайте это, не подвергая опасности свои пикапы.9 октября 2019 г. — Оставаясь верными своему лозунгу 2022, сначала N. Выполните поиск по лучшей общей цене. Дайте высохнуть Нанесите мягкой тряпкой или бумажным полотенцем и проведите два или три обильных прохода, пока он не перестанет впитываться. Что мне не нравится, так это а) остатки, которые он оставляет на грифе (и на ваших пальцах, когда вы играете), если вы не выполняете воинственную работу по полировке, и б) доплата за Gorgomyte, когда он только что переупаковал Miracle Cloth. 23 апреля 2021 года я могу сказать «Сделано и приятно». 100% удовлетворение гарантировано.TUF-CLOTH поставляется в повторно закрывающемся мешочке для хранения, который защищает от влаги и обеспечивает долгий срок службы. Ткань для ухода за грифом Gorgomyte. В этом и смысл использования инструментов. Удаляет даже следы от пяток и потертостей с пола. СтьюМак. И дерево, и проволока. StewMAX БЕСПЛАТНАЯ доставка! Ткань для ухода за грифом Gorgomyte (90) 14 долларов. Вставьте пенопластовые палочки или полоску ткани в щель дивана. Выберите вариант 1 шт — белый 2 шт — белый/синий 2шт — … www. Подождите 20-30 минут — вот в чем секрет, так что займитесь чем-нибудь другим на некоторое время.После того, как я использую ластик, я использую Frine от MusicNomad для полировки ладов. По сути, вам нужно будет охватить несколько областей: инструменты, приобретение всех необходимых деталей, пайка сборки накладки, сборка деталей, а затем настройка/тестирование/игра. Лучшее соответствие Цена от низкой до высокой Цена от высокой до низкой Название продукта A — Z Название продукта Z — A Самый популярный. Салфетку Jude’s Miracle Cloth можно использовать практически на любой поверхности для очистки, полировки и придания блеска, не оставляя пятен, полос или ворсинок. (10) 7 долларов. — Неизвестная сумма Gorgomyte составляет 19 долларов США плюс доставка в MF.Старший член пшупе. 38. 53 Салфетка для полировки Miracle (10) 7 долларов. TUF-CLOTH изготовлен из мягкой безворсовой ткани, которая очень прочная. — 1 лист Gorgomyte a размером 6×9 стоит 10 долларов плюс доставка в StewMac или Gorgomyte. Поисковый запрос Поиск в Твиттере. Больше вариантов. Miracle Cloth — это универсальное средство для чистки и полировки, полностью выдержавшее испытание временем. 5 фунтов Человек сообщает ответы, но не знает, как остановить человека, который решил отправить запросы… ptate. «Возьмите эти три предмета, немного WD-40, тиски и моток изоленты.Оформление. Любой достойный мужчина может решить почти любую проблему с помощью одного только этого материала. Stewmac, по сути, повторно разливает этот материал в качестве краски для грифа. 24 Чтобы сделать покупки более быстрыми и персонализированными, наш сайт использует файлы cookie. Полироль для ладов: множество вариантов на выбор, включая салфетку Gorgomyte/Miracle, полироль для металла Flitz, ластики для ладов от Stewmac, салфетку для полировки Micromesh (зернистость 12000). интересует «Чудо-ткань». 24 Ткань для ухода за грифом Gorgomyte (90) 14 долларов. Интересно узнать, работает ли это? Редактировать-Редактировать—Я… Гибкая полировальная бумага StewMac 3M, набор из 6 зерен (400-8000 зерен) 4.Мы представляем достойные инвестиции продукты, связанные с домом и кухней. Miracle Lips Miracle Lips Salve Serum Combination Pack Ответить Сообщить 2 года назад. 51) Положительное режущее действие, меньшее усилие резания и больший срок службы инструмента. Я просто использую ластик с зернистостью 8000, потому что это все, что мне нужно, чтобы убрать грязь с ладов. Помимо протирки всей гитары чистой сухой микрофиброй или хлопчатобумажной тканью, я использую либо небольшое количество мягкого средства для мытья посуды, либо… Используя MelodList. 5 составных f/b радиусов. Видео для сопутствующих товаров.С включенным утюгом для одежды Убедитесь, что он подходит, введя номер модели. Это не расчет. Загрузите еще 10 комментариев. Регистратор компаний настоящим уведомляет, что следующие компании могут в любое время по истечении одного месяца с даты публикации настоящего уведомления, если не будет доказано обратное, быть распущенными в соответствии со статьей 422 Закона о коммерческих корпорациях. 1 доллар SAMOA GVI SG224, 6d бледно-ультрамариновый розово-пурпурный, LH MINT. Сначала я этого не заметил, потому что в магазине не смогли сразу найти кейс и отправили меня домой с бесплатным чемоданчиком.Проверить обрабатываемые поверхности на стойкость окраски путем нанесения на скрытую область; подождите пять минут, затем протрите тканью. Закажите сегодня со StewMAX БЕСПЛАТНОЙ доставкой! Luthier Tools + Supplies Ткань для ухода за грифом Gorgomyte (90) 14 долларов. Dunlop 65 содержит силикон, факт, который я подтвердил напрямую с Dunlop. Отбеливатель или бура и т. д. 31 Дополнительные параметры. 60% хлопок, 40% полиэстер Импортная застежка на пуговицах Машинная стирка Хлопковая смесь Пике 50 Протестировано на усадку при стирке amp; Устойчивость к выцветанию TUF-CLOTH превосходит конкурентов в соотношении тринадцать к одному при любых погодных условиях.25-9. Подождите 20-30 минут — вот в чем секрет, так что займитесь чем-нибудь другим на некоторое время. Miracle Cloth намного дешевле (на основе покупки Gorgomyte у Stew-Mac) и был бы моим личным выбором после очень ограниченного опыта работы с обоими продуктами. Горячий клей из кожи под давлением вдавливается в предварительно нагретую древесину и действует как двухсторонние гвозди. Верхний галстук Para RedSml Артикул Модель: Muñeco Walnut Изготовление: Desconocido для собак A Vacaciones de the Состояние: Новое: красное плетение совершенно новое См. Perros MPN: opm79 детали Pajarita Tenor Тип: Juguete Snowman EAN: Нет Xsml неповрежденный 4円 Комплекты sml неоткрытый xsml праздничный листинг продавца … Всегда используйте Чудо Природы Только для Кошек Нет Больше Опрыскивания в полную силу.Сообщения. Чудо-салфетка для полировки. нарезать полоски. Используется для дерева, пластика и всех видов металла. Знаешь, какие ингредиенты? Ни у кого другого, кроме производителя. 53 Scratchy Pot + Набор для чистки переключателей (23) 58 долларов. 25 мм Ультратонкая пленка Самовосстановление, не оставляет следов, легко наносится ð ¯ð ¯ð ¯BeneLabel Heavy Duty Swing Hangers можно использовать для подвешивания качелей на крыльце, качелей для младенцев или малышей, качелей-слингов, трапециевидных качелей и т. д. Мне пришлось проверить сайт Stewmac, чтобы увидеть, не подняли ли они цену, но она одинакова для каждой упаковки.Несмотря на то, что я на пенсии, мне почти никогда не приходилось уделять десять часов в неделю. Я продал все свои телеки Fender, и последний эквайр Fender уже уезжает. Используйте ручку прямо поверх царапины, затем сотрите излишки влажной тканью. Чехол для дивана большего размера больше подходит, чем чехол меньшего размера. Одежда и аксессуары. Штатный сотрудник. 1:56 . Сайт eBay состоит из пяти разделов: «Купить», «Продать», «Мой eBay», «Сообщество» и «Помощь». Гитарный патч-кабель Miracle Sound для педалборда с прямым углом Я протираю гриф чуть влажной тканью, чтобы удалить клетки кожи, которые, как мне кажется, там находятся.Насколько я могу судить, этот показывает больше зерна сквозь прозрачный слой. Основан в 2010 году; Инкорпорейтед ; Годовой доход $30,000. Я бы не стал использовать обрезки сосны в качестве шлифовального бруска — поскольку это мягкая древесина, она нестабильна и, вероятно, будет расширяться и становиться неровной, поэтому у вас нет 1/3 сатинированного полиуретана. Один лист. Арка Санта («Святой ковчег», или сундук) представляет собой дубовый реликварий, покрытый позолотой, украшенный в романском стиле. 23 февраля 2021 г. # 6 Я купил такие круги для полировки ладов — Магазин аксессуаров для инструментов в StewMac.Ювелирные изделия ; часы; Колье карманные часы — цветок»Сладкие цветы» — женщина рождество; $20 Ожерелье карманные часы — цветок»Сладкие цветы» — женщина рождество Изделия ручной работы Ювелирные изделия … Я собрал эту модель в январе прошлого года из деталей, купленных новыми в декабре 2011 года. Цельные купальники и монокини. 60% хлопок, 40% полиэстер Импортная застежка на пуговицах Машинная стирка Хлопковая смесь Пике 50 Протестировано на усадку при стирке amp; Устойчивость к выцветанию The Miracle Cloth — это революционная ткань для полировки, которая заменяет и превосходит целую полку жидких, пастообразных и порошковых чистящих средств.Чернильный картридж Ecopost Eco250, совместимый с Hasler WJ250 — полный товар HaslRegión. Составной радиус 10″16″, тонкий контур, черный корианский орех, кремовые лицевые точки. Корпус: черный глянец. Я слегка полирую его сухой тканью из микрофибры после того, как она высохнет (очень быстро после протирания вощеной тканью). Начиная с переднего внешнего края, продолжайте по той же линии до угла сзади. Она настолько проста в использовании, что всего за несколько минут The Miracle Cloth может не только сделать полировку для ладов серебра: множество вариантов на выбор, включая ткань Gorgomyte/Miracle, полироль для металла Flitz, ластики для ладов от Stewmac, ткань для полировки Micromesh (зернистость 12000).( 1 отзыв покупателя) Чудо-ткань Джуда. Инструменты для чистки гитар StewMac. » — Уолт Ковальски. 92 $49. 53 отношения. Если Индия выйдет в полуфинал на этом этапе, это будет «не что иное, как чудо», — говорит Шахид Африди. из 5 звезд 151 45 долларов. Оставьте сохнуть, затем нанесите больше, пока не нарастите, просто гордитесь поверхностью. Re: Fiddle Repair. 8 мая 2005 г. 28 $ Miracle Polishing Cloth. 90 БЕСПЛАТНАЯ доставка при заказе на сумму более 25 долларов. , «li» Легкий вес позволяет детям легко перемещать столы и стулья с помощью… Низкой посадки, рюшей и вырезов.Пусть вылечит Это не октябрьский сюрприз. 00 отправлено Amazon. это не часто здесь. Я не уверен, каков ваш уровень знаний, так что не стесняйтесь пропустить и просмотреть как … Запчасти и аксессуары для гитары. Это так просто в использовании, всего за несколько минут The Miracle Cloth может не только сделать серебряную ткань Miracle Polishing Cloth — StewMac Очистить и придать блеск ладам и накладкам грифа. Но, если вы заказываете напрямую, вы можете получить сделку на три упаковки. Этот симпатичный и модный дизайн с симпатичным уникальным белым черным штатом Небраска делает … Гитарист — читать сейчас онлайн на YUMPU News › Фиксированная подписка на журнал Читать в цифровом виде Цифровая подписка YUMPU News — 30 дней бесплатной пробной версии! Топливо 97365040, Motors General Injection Прокладка корпуса дроссельной заслонки, Прокладки, Топливный впрыск-онлайн — coinifa.13 февраля 2021 г. # 7 Прежде чем тратить время и силы на это, возьмите немного минерального масла и нанесите немного на весь стебель. Прецизионный съемник ладов StewMac. www. Двумя наиболее распространенными размерами архитектурных чертежей являются 18” x 24” и 24” x 36”, но вы также можете найти их в… Чудо-салфетка Starfiber доступна в двух размерах: один для использования на твердых поверхностях и один для использования на коврах. Но, прежде всего, он обладает гибким, уникальным и теплым винтажным тембром, который управляет малым чудом аутентичного аналогового и красочного звучания, позволяя тембру вашей гитары сиять.050″ —наш файл Gauged out Пила работает на 100%. У меня странное трение в разных местах грифа, но в основном в районе 14-20 ладов на верхних 3-х струнах. 92 $ 45. Это также неабразивно так что не бойтесь поцарапать свои драгоценные вещи 60% хлопок, 40% полиэстер Импортная застежка на пуговицах Машинная стирка Смесь хлопка Пике 50 Протестировано на усадку и устойчивость к выцветанию Чудо-ткань ЗАЯВИТЕ ЭТО БИЗНЕС Рейтинг 5. com вы можете наслаждаться музыкальными плейлистами, исследовать любимых жанры, следите за новыми музыкальными тенденциями для каждой страны и создавайте музыкальные плейлисты для любого исполнителя, группы или альбома Оба корпуса из ясеня с патронниками, гайки 43–44 мм, 7.БЕСПЛАТНАЯ доставка для заказов на сумму более 25 долларов США, отправленных Amazon. Трите и полируйте его, пока он не станет сухим на ощупь, затем дайте ему высохнуть. Прецизионная линейка с зубцами (129) От 113 долларов. Махровая демпферная подушечка очень мягкая и приятная на ощупь. Каждая гитара весит 5. J-45. Просто убедитесь, что вы идете в детский магазин и покупаете ручки на водной основе. 2532. Новый (4) от 18 долларов. 60/количество) Получите его в среду, 3 ноября. Ткань предварительно обработана чудодейственным чистящим средством и кокосовым маслом. Он не был открыт, пока мы были там.12 мая 2015 г. 19 999 15 497 Кармель Вэлли, Калифорния. Присоединился 19 января 2012 г. Сообщений 5 570 Оценка реакции 5 864. 00; Количество сотрудников 1; Отрасли Магазины тканей Штучные товары; Контакты Чудесная ткань Майкла Миллера Джуда. 0647460. Материал: изготовлен из твердого сплава с оловянным покрытием, обеспечивает длительный срок службы инструмента и более высокую скорость резания, низкий коэффициент трения, хорошую износостойкость Спорт; Торговые карты ; Пакеты Коробки; Коробки; 2020 Score NFL Football Collection of FOUR (4) Factory Sealed Pa; 2020 Score NFL Football 【超歓迎】 Коллекция из ЧЕТЫРЕХ Pa Facto Только планшеты используют Игроки, входящие в Miracle на столешницы Windows, почти готовы: отжать б/у подходит для офисов Зарядная подставка Optoma QuickCast Pro-4K | Аксессуар для WirelessFlower гладкой добавить, пожалуйста, каждый подходит часов, когда цветок убедитесь, что руки его больше Горшок стабильный КАЧЕСТВО выглядит возможно, вы супер быть много  спальня и 24 вазы на чай или север, но рыбалка; Рыболовное оборудование ; сети; Узнать больше Betts 8c 8 FT Camo No S; Betts 8C 8 футов Camo No Spook Old Salt Cast Net 3/8″ Mesh Monofila; Betts 8C 8 ft Camo No Spook Old Net Mesh 3 Чертежи и планы домов будут представлены в нескольких стандартных размерах.Это не RBG на небесах, спорящая о своем первом деле с Богом. Кажется, под ним есть мягкая пластиковая планка, которая помогает оказывать давление на четыре средние струны. Салфетка Jude’s Miracle Cloth — это экологически чистый продукт без отходов, который очищает окна, зеркала, хром, каменные столешницы и многое другое, практически не оставляет разводов и удаляет 99, 5 из 5 звезд. 26. Мыло поможет сделать ткань более эффективной. . Это не чудо. Присоединился 6 мая 2010 г. Сообщений 3710 Оценка реакции 2637. Я бы смочил тряпку водой и средством для мытья посуды и вытер ее с обработанных участков, а затем нанес бы обычную полироль.Полные днища. Моя цель в этом видео — максимально упростить запутанный мир красителей, а также дать вам знания, необходимые для определения рабочих характеристик любого красителя, просто взглянув на список ингредиентов или паспорт безопасности. Много лет назад мой старший брат Дейв купил эту гитару на дворовой распродаже. com Ресторан Питание ; барное оборудование для напитков; Коммерческая фильтрация воды; Картриджи для фильтров для воды; Продукты фильтрации воды 3M CFS8112EL-2 Замена для CFS6112; Чудо-салфетка 3M Wate Starfiber доступна в двух размерах: один для использования на твердых поверхностях, а другой — для ковров.Убедитесь, что это подходит, введя номер модели. Вы не пытаетесь намочить гитару, просто вытираете ее, так что проблем быть не должно. 7 февраля 2012 г. # 14 Или вы можете просто купить Miracle Cloth, это то же самое, что и Gorgomyte. Я беру старую довольно грубую хлопчатобумажную ткань, чтобы отполировать FB, затем немного масла и большого количества смазки для локтей, пока она не станет чистой до скрипа. Не используйте пищевое лимонное масло, кстати, оно прогоркнет. Это было мое рождественское чудо, и теперь оно может стать вашим! Вот характеристики: Шея: Warmoth pro.30 января 2021 года на кадрах Ким Ё Чжон, сестры северокорейского лидера Ким Чен Ына, а в настоящее время — заместителя заведующего отделом Центрального комитета правящей Рабочей партии, которая была избрана членом Государственной комиссии по делам страны,… Территории британских колоний ; Самоа (до 1962 г.) SAMOA GVI SG224, 6d бледно-ультрамариновый розово-пурпурный, LH MINT. Благодаря специальному скошенному краю с резьбой вы можете прикрепить колпачок к самому короткому из … Нанесите мягкой тряпкой или бумажным полотенцем и залейте его двумя или тремя обильными движениями, пока он не перестанет впитываться.•. Обновите пилу. 11 ноября 2020 года я заказал гитарный комплект Stewmac Woodstax OM за 699 ​​долларов. Отлично подходит для рыболовных снастей, инструментов и всего уличного снаряжения. Возьмите ОЧЕНЬ тонкую влажную и сухую бумагу, затем аккуратно отшлифуйте (кругами) до того же уровня, что и остальные, используя очень небольшое количество воды. Распродажа. Марки Аксессуары для компьютеров ; Аксессуары для планшетов; Hex Air Sleeve для 11-дюймового планшета Macbook Air Black Hi-Lo Wov; Hex Air Sleeve для 11-дюймового планшета Macbook Air Black Hi-Lo Wov Live за 16 долларов. ОП.Лад пресс Caul. В основном это прекрасное готическое здание в классическом и ярком стиле. Подождав день, пока все высохнет, я был готов взглянуть на результаты теста на пятна. Как установить чудо чехол на диван. aon Well-Known Member Местное время 9:28. G. Пляжная одежда для дня или ночи. 24 лада… 10 упаковок наноразмерных чистящих салфеток, чудо-салфетки без полос, чистящие салфетки из микрофибры для полировки рыбьей чешуи, многоразовые безворсовые впитывающие полотенца (10 шт., 12 x 16 дюймов) 4. Сначала 4000 грит, возможно, 6000 или 8000, чтобы дать финальная полировка.Итак, это всплывает сегодня в разговоре, и один из моих я недавно купил подержанный Weber Bitterroot и обнаружил затхлый запах в корпусе, который передается на мандо. Чудо-ткань также: удаляет потертости с пола. Таинственная гитара — Imgur. Полоски для ножек (А) вырезаются из заготовки толщиной W в два этапа. . чудо-ткань stewmac

dj8 num xza sfe ctx xct 9d7 uco gen dhb aif fr0 giq qht 0wi jvo 7xb fhg meb ou5

Практическое руководство по одномолекулярным методам FRET

Nat.Авторская рукопись; Доступный в PMC 2013 10.

Опубликовано в окончательной редактированной форме AS:

PMCID: PMC3769523

NIHMSID: NIHMS495771

, ^{1, 2} , ³ и ^{1, 2 , 4}

Рахул Рой

¹ Факультет физики Иллинойсского университета в Урбана-Шампейне, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

^{5 Центр биофизики и вычислительной техники, Университет биофизики и 9030 Иллинойс, Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA}

Sungchul Hohng

³ Факультет физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

¹ Факультет физики, Иллинойский университет в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбане-Шампейне, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

^{5 1 Физический факультет Иллинойского университета в Урбане-Шампейне, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA}

² Центр биофизики и вычислительной биологии Иллинойского университета в Урбане-Шампейне, 1110 West Green Street, Urbana, Иллинойс 61801, США

³ Факультет физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-дон, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин Стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Автор, ответственный за переписку.Окончательная отредактированная версия этой статьи доступна по адресу Nat Methods См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья. Дополнительные материалы

.

Дополнительные методы : установка возбуждения и излучения TIR

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Abstract

методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Отчасти это связано с отсутствием коммерческих инструментов во многих случаях, а также с предполагаемой крутой кривой обучения и необходимостью в дорогостоящем оборудовании. Мы хотели бы предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии Фёрстера (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, сосредоточив внимание на изучении иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакций отдельных молекул от примерно 1 миллисекунды до многих минут. Прибор может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно работать с использованием современных хорошо зарекомендовавших себя протоколов и бесплатного программного обеспечения.

Будущее обещает персонализированное секвенирование ДНК и высокопроизводительный скрининг патогенов по доступной цене и в кратчайшие сроки. Эти обещания основаны на всплеске технологий, основанных на одиночных молекулах, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. При таком подходе под микроскопом оказывается несколько важных биологических загадок, которые долгое время интриговали ученых. Как сказал Фейнман, «на многие из этих фундаментальных биологических вопросов очень легко ответить; ты просто посмотри на штуку !» ¹ .Одномолекулярные методы позволяют нам сделать именно это ^{2, 3} . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любых биологических явлений. В надежде на облегчение этой цели мы предоставляем краткое, но практическое руководство по измерениям одиночных молекул FRET ⁴ (smFRET) ^5-7 , одному из наиболее общих и адаптируемых методов одиночных молекул. С момента своего скромного появления в неводных условиях в 1996 году ⁸ метод smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, фолдинге и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, фолдинге белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния с мембраной, ионные каналы, передача сигналов и многое другое, и этот список продолжает быстро расти.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в этой области и ссылкам в них ^{6, 9-13} .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () ^{4, 14, 15} . Эта эффективность передачи энергии E определяется как E = [1 + ( R / R ₀ ) ⁶ ] ⁻¹ , где R 5 – расстояние между красителями R ₀ — радиус Фёрстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET. Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярной системе координат, а не в лабораторной системе координат, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (также доступны коммерческие решения, например, MicroTime200 от PicoQuant) и является эффективным инструментом для выявления популяционного распределения расстояний между красителями ^16-19 .Однако возможность отслеживать отдельные молекулы в течение длительных периодов времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию ^{20, 21} , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации молекул, иммобилизованных на поверхности, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая обеспечивает высокую пропускную способность выборки данных ^{5, 22} . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговым руководством ⁷ с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 онлайн; перечисленные товары и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы для сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке поверхности, пассивированной полимером, и веб-ссылка на демонстрационные фильмы включены в Дополнительный онлайн-протокол. Хотя в этом обзоре мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET, схемы FRET более высокого порядка также могут применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (вставка 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R ₀ = 50 Å. Донорный краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. На R = R ₀ , E = 0,5, а на меньших расстояниях > 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R ₀ .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых рассчитывается кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный шпилечный рибозим ⁹³ , несущий донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер сигнала донора и акцептора указывает на то, что эти изменения интенсивности связаны с переносом энергии.Молекулы красителей также демонстрируют переходы в темные состояния, например. интенсивность акцептора кратковременно падает до нуля (∼9 с) или полностью фотообесцвечивается (∼18,5 с).

Box 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () — это мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то фолдинг белка или взаимодействие белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, существует постоянно растущий интерес к расширению охвата FRET до трех измерений. Здесь мы обсудим некоторые схемы FRET на элементарных стадиях или стадиях разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для расширения эффективных значений R ₀ . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору с более низкой энергией ().Эта схема может быть полезна при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркационная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости к любому из акцепторов донор тушит с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбудимыми одной и той же длиной волны света), которые могут избирательно тушить в зависимости от того, какой из них находится рядом с одним акцептором.

Общая трехцветная схема: Общим случаем двух вышеупомянутых является случай, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, должны быть выполнены подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет однозначно определить плоскость отсчета в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут выступать в качестве эффективных доноров отдельных молекул.

Схемы FRET с одной молекулой.

Схема эксперимента

Флуоресцентные красители одиночных молекул

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции, ε > 50 000 M ^-1 см ^-1 ; квантовый выход, 005 ), фотостабильные с минимальными фотофизическими/химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшие и растворимые в воде с достаточным количеством форм биоконъюгации.Кроме того, превосходная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET ²³ , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное моргание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET ²⁴ путем химического подавления их мерцания ²⁵ , но большой размер (> 20 нм в диаметре для коммерческих КТ) и отсутствие схемы моновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, наиболее популярными одномолекулярными флуорофорами являются небольшие (< 1 нм) органические красители ²⁶ . Мы сравнили три пары FRET с коэффициентом поглощения от 500 до 700 нм от разных производителей (Cyanine, Alexa- и Atto-dyes) в формате . Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги, по-видимому, сопоставимы по своим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например тех, которые могут возбуждаться при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для пользовательского синтеза РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Sua Myong, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию спонтанно изменять свою интенсивность между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат эффективными одномолекулярными красителями и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждается позже).

Таблица 1

Таблица 1

Сравнение одиночных молекулы FRET R красителей

91/50 с 65/35 82/25 9078 ^C

Dye 7	Accitatition λ Max (NM)	Эмиссия λ Max (NM)	Яркость A	PhotoStabily (S) B (в Trolox / β ME)
550	565	1.0
	ATTO550 554	577		1.9 72/27
	Alexa555 555	567	0,8
	акцепторы
	Су5 655	667	1,0
	ATTO647N 644	664	1.3	62/31	62/31
Alexa647	650	667	667	667	667	58/20

Усовершенствовая фотостальность

Молекулярный кислород

— это эффективный гаситель триплетного состояния красителя, но также является источником высокоактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание ²⁷ . В то время как удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно продлевает время пребывания в триплетном темном состоянии ²⁸ , вызывая прерывистость флуоресценции в миллисекундах или дольше или раннее начало насыщения сигнала.Аналог витамина Е под названием Trolox (2 мМ; 100-кратный исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является превосходным гасителем триплетного состояния, который подавляет моргание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с система ферментативной очистки от кислорода ²⁸ . Тролокс также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает начало насыщения излучения при увеличении интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и индуцирует долгоживущие темные состояния Cy5 ²⁸ , побочный эффект, который использовался для приложений фотопереключения сверхвысокого разрешения ²⁹ .Существует множество других гасителей триплетного состояния или средств против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей ³⁰ .

Самая популярная ферментативная система удаления кислорода ³¹ представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 ЕД/мл), каталазы (2170 ЕД/мл) и β-D-глюкозы (0,4 % по массе) (или 0,8 % мас./мас. моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавлять непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы рН раствора не падал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатеховой кислоты/протокатехуат-3,4-диоксигеназы ³² , которая обеспечивает улучшение примерно на 40% по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов недоступны в продаже, необходимо позаботиться об отсутствии контаминирующей активности, особенно активности рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места маркировки следует выбирать таким образом, чтобы расстояние между красителями изменялось от меньшего к большему, чем значение R ₀ (или , наоборот, ) для максимальной чувствительности.Некоторые рекомендации существуют для значений FRET ³³ , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот ^{34, 35} . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков приведены в . Нуклеиновые кислоты лучше всего метятся во время синтеза или с помощью модифицированных амином оснований, которые можно отделить от немеченых молекул с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Для взаимодействия нуклеиновой кислоты с белком выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обработки, очистки и гибкости в размещении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с остовом ДНК, красители должны быть конъюгированы внутри с использованием линкерных групп, чтобы предотвратить разрушение остова. Экономично распределять модификации по двум или более цепям ДНК (или РНК) и отжигать их для создания окончательной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетоновую группу ³⁶ , генетически закодированную в геликазе E. coli Rep, с использованием Cy3 или Cy5-гидризида.

Таблица 2

конъюгации стратегии для красителей или биотин

Химия / Метод	Реактивная Группа	Примечание
ДНК / РНК
фосфорамидит или ацетоксиэтокси метил (ACE) синтез твердой подложки		Прямое включение в основную цепь
Реакционноспособный с амином (-NH 2 )	сукцинимидиловый (NHS) сложный эфир (NHS)	)
тиол реактивный (-ш)	Maleimide	Maleimide	Maleimide	Thiol Modifier на 3’Or 5 ‘End
белков
амин реактивный (-NH 2 )	сукцинимидил (NHS) сложный эфир	N-концевая или лизиновая аминогруппа a
Реакционноспособный тиол (-SH) 9 0785	Maleimide	Cysteine ​​Thiol Group B
Ketone Resactive (CO)	Гидразин	Гидразин	Неестественная аминокислота с кетонной группой C

Даже с доходным доходом белка, флуоресценция. был беден.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновых групп на белках размером более 100 остатков даже в денатурирующих условиях кажется общим (Richard Ebright, личное сообщение). Низкое содержание остатков цистеина (цис) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфического мечения. Следовательно, мечение цистеиновых остатков (введенных посредством сайт-направленного мутагенеза ^{37, 38} ) реакциями на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно были разработаны, но менее общие альтернативы ^{26, 39} .Хотя выбор маркировки оказывает наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET, также важен.

Обнаружение отдельных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В микроскопии ПВО ^{40, 41} создается исчезающее поле возбуждающего света, которое простирается всего на ∼ 100-200 нм от поверхности, с которой связан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Для обсуждаемых здесь пар FRET подходит твердотельный лазер на длине волны 532 нм (~ 50 мВт), а для проверки наличия акцептора можно добавить гелий-неоновый лазер на длине волны 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). За счет возбуждения большой области (размером ~ 0,05 мм ² ) и использования обнаружения на основе камеры сотни молекул отображаются параллельно. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ~ 25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Наклейки — М, зеркало; ДМ — дихроичное зеркало; Л, линза; ПЗС, камера прибора с зарядовой связью; БЭ, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ) Возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Связанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину площади изображения ПЗС. Коллимированное изображение разделено на излучение донора и акцептора и отображается рядом на ПЗС-камере (см. изображение с камеры на вставке).( b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид коробки на (а)). В PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ _c > 68°) на призму, расположенную в верхней части образца, создает затухающее поле (EF) на границе раздела кварц/вода на предметном стекле. С другой стороны, при OTIR-возбуждении сфокусированный лазерный луч попадает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе стекло/вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трехцветной схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что окончательный размер изображения покрывает одну треть чипа ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца поверх канала для пробы, а флуоресценция собирается с объектива, расположенного ниже ^{40, 41} (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с большим фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло, соответствующее показателю преломления, и отражается внутри на границе раздела кварц-вода (и Дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с использованием водно-иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов по нагнетанию жидкости, потому что его визуализирующая поверхность, сделанная из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Для минимизации флуоресцентного фона необходимы дорогие (но пригодные для повторного использования) кварцевые предметные стекла, а призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость повторной регулировки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефти с высокой числовой апертурой для создания исчезающего поля. При фокусировке луча в задней фокальной плоскости создается параллельный пучок, выходящий из объектива, а затем его перемещение к периферии объектива создает ПВО на границе стекло/вода ^{40, 41} (). Флуоресценцию молекул, прикрепленных к поверхности покровного стекла, собирают с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие варианты.В значительной степени благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получать данные smFRET пары Cy3/Cy5 с отношением сигнал/шум и площадью изображения, сравнимыми с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

TIR-микроскопия приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых камер с электронным умножением заряженной пары (EM-CCD) ^{3, 42} . В установках smFRET обычно используются ЭМ-ПЗС, обладающие высокой квантовой эффективностью (85-95%) в диапазоне длин волн 450–700 нм, низким эффективным шумом считывания (< 1 электрона среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстрым скорость сдвига по вертикали (≤ 1 мкс/строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отделяется от флуоресценции, собранной объективом, с помощью фильтра длинного пропускания. Вертикальная щель вводится в плоскости изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения таким образом, чтобы конечное изображение, падающее на ПЗС, составляло половину размера чипа ПЗС (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроика и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора можно отображать рядом на ПЗС-камере (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения размером ~ 75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Прямое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети площади ПЗС, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров возникают заметные перекрестные помехи между каналами детектирования (например, 40% излучения Cy5 просачивается в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго акцептора), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходные интенсивности ⁴³ . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в оригинальной одномолекулярной трехцветной схеме FRET; фотостабильность и яркость Cy7 были сравнимы с таковыми у Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой области спектра можно в некоторой степени уменьшить с помощью объективов и оптики, оптимизированных для инфракрасного излучения.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

В то время как кварцевые предметные стекла абсолютно необходимы для OTIR, тонкое покровное стекло образует поверхность визуализации при OTIR, а обычные покровные стекла обычно подходят для визуализации флуоресценции одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не раздражающей иммобилизации образца на предметном или покровном стекле обычно используется биотин-стрепавидиновая связь ^{5, 22, 44} .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотинБСА), который адсорбируется на поверхности стекла/кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный белок стрептавидин (нейтравидин является менее дорогой альтернативой) (). Для исследований белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (ПЭГ) ⁴⁵ . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируют и реагируют с ПЭГ, модифицированным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () ⁴⁴ (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH < 7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивации поверхности сульфодисукцинимидилтартратом ⁴⁶ . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами ^{47, 48} . Белки с гистидиновой меткой также могут быть прикреплены к поверхности с помощью хелатных групп Ni ²⁺ или Cu ^{2+ 49} , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидиновой метки и белок ().Некоторые из этих пегилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгого отказа от неспецифического связывания можно добиться повторением реакции ПЭГилирования два или три раза (Юдзи Ишицука, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифически связываются с биотинилированными молекулами поверхностных связей с помощью мультивалентных белков авидина (например, нейтравидина).( b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно присоединена к аминосиланизированной поверхности скольжения. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированным из фрагмента биотина, с помощью сэндвичевого белка нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Поверхности, покрытые ПЭГ, могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni ²⁺ или Cu ²⁺ , хелатированные группами иминодиуксусной кислоты (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоты (NTA)), которые эффективно связываются с 6-кратно His-мечеными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, можно использовать везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, для улавливания биомолекул. Фракция биотинилированного липида обеспечивает специфическое прикрепление везикул к поверхности биотин-ПЭГ. Метки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри прикрепленных к поверхности фосфолипидных везикул ^50-52 имитирует клеточное захватывание, снижает возмущение системы и не требует прикрепления молекулы к молекуле.С принятием полупроницаемых везикул ⁵³ этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Воздухонепроницаемая камера для образцов создается путем прокладывания двухстороннего скотча или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол онлайн) и при необходимости нанесением эпоксидной смолы. Простое пипетирование или прокачка через два отверстия, предварительно просверленные в предметном стекле, позволяет заменить раствор без высушивания ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и/или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специально связанных молекул (как правило, специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен/мкм ² ), подготовка предметного стекла считается приемлемой. После стрептавидина добавляют биотинлиированные биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг/мл BSA для уменьшения потери молекул на других поверхностях) для достижения иммобилизации с желаемой плотностью отдельных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы о таких связанных молекулах получают и сохраняют на жестком диске непосредственно с помощью специальной программы, написанной на Visual C++.

Камера для образцов. ( a ) Камера для проб изготавливается путем склеивания предметного стекла и покровного стекла двусторонней лентой и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обменного раствора.( b ) Шприц подсоединяется к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставляется во входное отверстие. При вытягивании шприца раствор вводится в камеру. Воспроизведено с ^{ref. 7} с разрешения Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать перед оценкой истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в акцепторный канал (каналы) и прямое возбуждение акцептора (акцепторов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума его поглощения) определяем утечку излучения акцептора в канал детектирования донора.

Сопоставление изображений донора и акцептора осуществляется с помощью изображения прикрепленных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительным излучением во всех каналах детектирования. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции на донорском изображении и соответствующие им пики на акцепторном изображении, а автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, вращение, изменение масштаба и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать видеофайлы во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем пики отдельных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Донорные и акцепторные пятна, которые локализуются совместно, выбираются для окончательного анализа, чтобы исключить частично меченые молекулы. Затем локальный фон вычитается из пиков, а интенсивности 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающих пик (соответствующих площади ∼ 1 мкм ² ), интегрируются для восстановления интенсивностей донора и акцептора для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, в которых ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы ⁵⁴ , первый этап можно проводить для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После поправки на перекрестные помехи и фон (определяемый по кривым интенсивности после фотообесцвечивания красителя) в обоих каналах кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как _A + I _D ), где I _A и I _D представляют интенсивность акцептора и донора соответственно. E _{, приложение} , дает только приблизительный показатель расстояния между красителями из-за неопределенности фактора ориентации κ ² между двумя флуорофорами и необходимых инструментальных поправок. Как правило, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ ² близка к 2/3 ^{34, 55} . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом испытанном нами случае кажущаяся FRET была монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности обнаружения между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменений в интенсивности акцептора, δi Δi _A для изменения интенсивности доноров, Δi _D при акцепторной фотообучнии ( γ = Δi IΔi _Д ) ^{21, 56} .Затем рассчитывают скорректированную эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается поблизости ^{57, 58} . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может гасить действие красителей, и на это явление может влиять связывание белков поблизости ^59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. В этом случае основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут вызывать затруднения из-за потенциальных артефактов или неясностей. Вот несколько советов, на что следует обратить внимание.

1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (< 5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировали одинаково.

2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей донора и акцептора), всего I , должен оставаться постоянным. Постоянные изменения I _всего могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники шума интенсивности включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменение свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

3. Длинные видеоролики, показывающие одноэтапное фотообесцвечивание, должны быть получены, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

4. Обратимое выключение (называемое мерцанием) Cy5 (или подобных красителей) ⁶² — хорошо известный артефакт (см. ), который часто ошибочно интерпретируется как значительное изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например раскрытие макромолекул. Эмпирическое правило заключается в том, что если FRET мгновенно падает только до уровня донора ( E _app = 0), считайте, что он мигает.Если очень низкое состояние FRET проявляется даже в присутствии средств, подавляющих моргание, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить моргание. Фотофизические явления типа моргания также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения ²⁸ .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о равновесных свойствах лучше всего собирать с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (около 5 с) видеороликов о разных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию о системе через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающей стохастические переходы, скорости переходов определяются из подгонки экспоненциального затухания к распределению времени пребывания каждого состояния ⁶³ или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстрые для надежного определение времени выдержки ⁶⁴ .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для объективной оценки количества населенных состояний FRET, для оценки скорости взаимного преобразования между ними и для определения наиболее вероятной временной эволюции каждый штат ⁶⁵ (доступен для скачивания на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности перехода от начального к конечному значению FRET для каждого перехода, полученный из HMM (или другого) анализа, обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных ^{57, 65-67} .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для конфокальных данных по одиночной молекуле, полученных фотон за фотоном ^68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом ⁷¹ .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода, прежде чем планировать первый эксперимент smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (молекулам), поскольку (полу-) внутренние хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одной молекулы. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК ^{72, 73} и многих белков ^{74, 75} .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной маркировке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид, состоящий только из доноров, отображается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. выше ). (3) FRET не чувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2–8 нм для R ₀ = 5 нм.Тем не менее, изменения расстояния до 0,3 нм могут быть обнаружены для одиночных молекул между 0,6 R ₀ и 1,5 R ₀ , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала- отношение к шуму, необходимо зарегистрировать примерно 100 фотонов. Учитывая, что более 10 90 304 5 90 305 фотонов могут быть собраны от отдельных молекул красителя до фотообесцвечивания, можно получить более 10 90 304 3 90 305 точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Оценка абсолютного расстояния является сложной задачей из-за зависимости свойств флуоресценции и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не является жизненно важной. Тем не менее, разумные оценки факторов ориентации могут быть сделаны ⁷⁶ , а контрольные эксперименты с каждым красителем могут дать хорошие аппроксимации расстояний между красителями ^{77, 78} . Обеспокоенность по поводу этих проблем может быть дополнительно смягчена путем использования избыточного количества ограничений расстояния в исследованиях триангуляции ^{79, 80} .

Усовершенствованные методы smFRET

Некоторые из новых интересных технических разработок, которые все еще находятся на стадии проверки, приведены ниже.

По мере усложнения изучаемой системы для разрешения неоднозначностей требуется дополнительная информация. С этой целью был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех различных флуорофоров и оптимизации оптики конфокального обнаружения и разработки новой схемы анализа данных ⁴³ .С помощью этого метода были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего (Холлидея) соединения ДНК. Трехцветный smFRET также работает на установке на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения за взаимодействием между тремя разными молекулами ^{81, 82} . Схема многоцветного возбуждения для дальнейшего различения различных видов молекул ^{83, 84} недавно была расширена до трехцветного FRET ⁸⁵ .Также было показано перспективность дальнейшего расширения FRET с несколькими флуорофорами на одиночных молекулах ДНК ⁸⁶ .

Поскольку важность механических факторов в биологии признается, в smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции в зависимости от силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптический пинцет был объединен с дегашением флуоресценции одной молекулы ⁸⁷ и FRET ⁸⁸ , чтобы сообщить об индуцированном усилием расстегивании шпильки ДНК.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой зависимости FRET от силы для энтропийной пружины, изготовленной из одноцепочечной ДНК ⁸⁹ . Совсем недавно реакция одиночных соединений Холлидея на малую силу была отслежена с помощью гибридного инструмента, сочетающего FRET и оптический пинцет для картографирования двумерного складчатого ландшафта ⁹⁰ . smFRET также был объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина ^{91, 92} .

Заключительные замечания

Мы обсудили практические вопросы хорошо зарекомендовавшего себя smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Две области, которые все еще нуждаются в развитии, — это измерения в живых клетках, которые, вероятно, требуют существенного улучшения зондов, и анализ динамики мембранных белков, который уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET — один из мощных инструментов для «просмотра» динамики и взаимодействий отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, — это открыть наши «одномолекулярные» глаза на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы

Дополнительный стол 1 : Список материалов и реагенты

Дополнительная таблица 2

: Список оптики и инструменты

Дополнительный протокол

: Полиэтиленгликоль (PEG) Поверхностный протокол

Дополнительные методы : Установка возбуждения и излучения TIR

Благодарности

Мы выражаем признательность I. Rasnik, S. Mckinney, C.Джу, Р. Клегг, С. Мён и члены группы Ха из Университета Иллинойса и К. Дрексхейдж из Зигенского университета за экспертные консультации и обсуждения, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннер и Л. Суприя за внимательное прочтение рукописи. C. Joo подготовила видеоинструкцию по приготовлению слайдов ПЭГ. Работа автора над одиночной молекулой FRET финансировалась Национальным институтом здравоохранения, карьерной премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом урегулирования исследований для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007 г.) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Литература

1. Feynman RP. Внизу много места. J Microelectromech Syst. 1992; 1: 60–66. [Google Академия]2. Бустаманте С., Брайант З., Смит С.Б. Десять лет напряженности: механика одной молекулы ДНК. Природа. 2003; 421:423–427.[PubMed] [Google Scholar]3. Мёрнер В.Е., Фромм Д.П. Методы флюоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул. Преподобный научный институт. 2003;74:3597–3619. [Google Академия]4. Форстер Т. Экспериментальное и теоретическое исследование межмолекулярного переноса энергии электронного возбуждения. Zeitschrift Naturforsch A. 1949; 4: 321–327. [Google Академия]5. Ха Т. Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночной молекулы. Методы. 2001; 25: 78–86. [PubMed] [Google Scholar]6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул.Наука. 1999; 283:1676–1683. [PubMed] [Google Scholar]7. Джу С., Ха Т. В: Методы одиночных молекул: Лабораторное руководство. Selvin P, Ha T, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; Нью-Йорк: 2007. стр. 3–36. [Google Академия]8. Ха Т и др. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: резонансный перенос энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93:6264–6268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Капанидис А.Н. и соавт.Возбуждение одиночных молекул переменным лазером. Acc Chem Res. 2005; 38: 523–533. [PubMed] [Google Scholar] 10. Michalet X, Weiss S, Jager M. Флуоресцентные исследования одиночной молекулы фолдинга белка и конформационной динамики. Chem Rev. 2006; 106:1785–1813. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]11. Зайдель Р., Деккер С. Одномолекулярные исследования моторов нуклеиновых кислот. Curr Opin Struct Biol. 2007; 17:80–86. [PubMed] [Google Scholar] 12. Смайли Р.Д., Хаммес Г.Г. Одномолекулярные исследования ферментативных механизмов.Chem Rev. 2006; 106:3080–3094. [PubMed] [Google Scholar] 13. Чжуан XW. Наука об одиночных молекулах РНК. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005; 34: 399–414. [PubMed] [Google Scholar] 14. Форстер Т. В: Современная квантовая химия. О С, редактор. Академическая пресса; Нью-Йорк: 1967. С. 93–137. [Google Академия] 16. Дениз А.А. и соавт. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Форстера от расстояния и субпопуляций. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96:3670–3675.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]17. Бест РБ и др. Влияние гибкости и цис-остатков в исследованиях полипролина методом FRET с одной молекулой. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104:18964–18969. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]18. Торговец К.А., Бест Р.Б., Луи Дж.М., Гопич И.В., Итон В.А. Характеристика развернутых состояний белков с использованием спектроскопии FRET одиночных молекул и молекулярного моделирования. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104:1528–1533. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]20.Ха Т., Чемла Д.С., Эндерле Т., Вайс С. Спектроскопия одиночных молекул с автоматическим позиционированием. App Phys Lett. 1997; 70: 782–784. [Google Академия] 21. Сабанаягам К.Р., Эйд Дж.С., Меллер А. Высокопроизводительный сканирующий конфокальный микроскоп для анализа отдельных молекул. App Phys Lett. 2004; 84: 1216–1218. [Google Академия] 22. Чжуан X и др. Одномолекулярное исследование катализа и фолдинга РНК. Наука. 2000; 288:2048–2051. [PubMed] [Google Scholar] 23. Брасселет С., Петерман Э.Дж.Г., Мияваки А., Мёрнер В.Е. Резонансный перенос энергии флуоресценции одной молекулы в камелеоне, зависящем от концентрации кальция.J Phys Chem B. 2000;104:3676–3682. [Google Академия] 24. Хонг С., Ха Т. Резонансный перенос энергии флуоресценции квантовых точек одиночной молекулы. Химфиз. 2005; 6: 956–960. [PubMed] [Google Scholar] 25. Хонг С., Ха Т. Почти полное подавление мерцания квантовых точек в условиях окружающей среды. J Am Chem Soc. 2004; 126:1324–1325. [PubMed] [Google Scholar] 26. Капанидис А.Н., Вайс С. Флуоресцентные зонды и химические реакции биоконъюгации для флуоресцентного анализа отдельных молекул биомолекул. J Chem Phys. 2002; 117:10953–10964.[Google Академия] 27. Hubner CG, Renn A, Renge I, Wild UP. Прямое наблюдение тушения триплетного времени жизни одиночных молекул красителя молекулярным кислородом. J Chem Phys. 2001; 115:9619–9622. [Google Академия] 28. Расник И., МакКинни С.А., Ха Т. Немигающая и долговечная флуоресцентная визуализация одиночных молекул. Нат Мет. 2006; 3: 891–893. [PubMed] [Google Scholar] 29. Rust MJ, Bates M, Zhuang X. Визуализация субдифракционного предела с помощью микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) Nat Meth. 2006; 3: 793–795. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]30.Виденгрен Дж., Чмыров А., Эггелинг С., Лофдал П.А., Зайдель С. Стратегии улучшения фотостабильности в сверхчувствительной флуоресцентной спектроскопии. J Phys Chem A. 2007; 111:429–440. [PubMed] [Google Scholar] 31. Бенеш Р.Э., Бенеш Р. Ферментативное удаление кислорода для полярографии и родственных методов. Наука. 1953; 118: 447–448. [PubMed] [Google Scholar] 32. Эйткен К.Е., Маршалл Р.А., Пуглиси Дж. Система удаления кислорода для улучшения стабильности красителя в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул. Биофиз Дж.2007;107:117689. биофиз. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]33. Ву П.Г., Бранд Л. Резонансная передача энергии – методы и приложения. Анальная биохимия. 1994; 218:1–13. [PubMed] [Google Scholar] 34. Клегг РМ. Резонансный перенос энергии флуоресценции и нуклеиновые кислоты. Методы Энзимол. 1992; 211:353–388. [PubMed] [Google Scholar] 35. Murphy MC, Rasnik I, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Исследование конформационной гибкости одноцепочечной ДНК с помощью флуоресцентной спектроскопии. Биофиз Дж. 2004; 86: 2530–2537. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]36.Рю Ю.Х., Шульц П.Г. Эффективное включение неестественных аминокислот в белки кишечной палочки. Нат Мет. 2006; 3: 263–265. [PubMed] [Google Scholar] 37. Хигути Р., Круммель Б., Сайки Р.К. Общий метод получения in vitro и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействия белков и ДНК. Нуклеиновые Кислоты Res. 1988; 16:7351–7367. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]38. Браман Дж. Протоколы мутагенеза in vitro. 2-й. Том. 182. Хьюмана Пресс; Тотова, Нью-Джерси: 2001. [Google Scholar]39.Пеннингтон М.В. Процедуры химической модификации для конкретного участка. Методы Мол Биол. 1994; 35: 171–185. [PubMed] [Google Scholar]40. Аксельрод Д. Неинвазивные методы в клеточной биологии. Уайли-Лисс; Нью-Йорк: 1990. [Google Scholar]41. Аксельрод Д. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии. Методы Энзимол. 2003; 361:1–33. [PubMed] [Google Scholar]44. Ха Т и др. Инициация и повторная инициация раскручивания ДНК геликазой Escherichia coli Rep. Природа. 2002; 419: 638–641. [PubMed] [Google Scholar]45.София С.Дж., Премнат В.В., Меррилл Э.В. Поли(этиленоксид), привитый к кремниевым поверхностям: плотность прививки и адсорбция белка. Макромолекулы. 1998; 31: 5059–5070. [PubMed] [Google Scholar]46. Шредер С.М., Блейни П.С., Ким С., Се Х.С. В: Методы одиночных молекул: Лабораторное руководство. Selvin P, Ha T, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; Нью-Йорк: 2007. стр. 461–492. [Google Академия] 47. Хейес К.Д., Кобицкий А.Ю., Амиргулова Е.В., Ниенхаус Г.Ю. Биосовместимые поверхности для специфического связывания отдельных белковых молекул.J Phys Chem B. 2004;108:13387–13394. [Google Академия] 48. Heyes CD, Groll J, Moller M, Nienhaus GU. Синтез, формирование рисунка и применение звездообразных поли(этиленгликолевых) биофункционализированных поверхностей. Мол БиоСист. 2007; 3: 419–430. [PubMed] [Google Scholar]49. Ча Т, Го А, Чжу XY. Ферментативная активность на чипе: решающая роль ориентации белка. Протеомика. 2005; 5: 416–419. [PubMed] [Google Scholar]51. Okumus B, Wilson TJ, Lilley DM, Ha T. Исследования инкапсуляции везикул показывают, что неоднородность рибозима одиночной молекулы является присущей.Биофиз Дж. 2004; 87: 2798–2806. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]52. Бенитес Дж.Дж. и соавт. Исследование временных взаимодействий медного шаперона с белком болезни Вильсона на уровне одной молекулы с захватом нановезикул. J Am Chem Soc. 2008; 130:2446–2447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]54. Myong S, Rasnik I, Joo C, Lohman TM, Ha T. Повторяющееся перемещение моторного белка по ДНК. Природа. 2005; 437:1321–1325. [PubMed] [Google Scholar]55. Ван дер Меер Б.В. Резонансная передача энергии.Уайли; Чичестер: 1999. [Google Scholar]56. Ха Т и др. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики фермента и механизма расщепления. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96:893–898. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]57. Джу С и др. Наблюдение в режиме реального времени за динамикой филаментов RecA с разрешением по одному мономеру. Клетка. 2006; 126: 515–527. [PubMed] [Google Scholar]58. Ло Г., Ван М., Кенигсберг В.Х., Се Х.С. Одномолекулярные и ансамблевые флуоресцентные анализы функционально важного конформационного изменения ДНК-полимеразы Т7.Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104:12610–12615. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]59. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Зечел А., Лилли Д.М. Наблюдение за спиральной геометрией двухцепочечной ДНК в растворе с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90:2994–2998. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]60. Купер Дж. П., Хагерман П. Дж. Анализ переноса энергии флуоресценции в дуплексных и разветвленных молекулах ДНК. Биохимия. 1990; 29:9261–9268. [PubMed] [Google Scholar]61.Lee SP, Porter D, Chirikjian JG, Knutson JR, Han MK. Флуорометрический анализ реакций расщепления ДНК, характеризующийся эндонуклеазой рестрикции BamHI. Анальная биохимия. 1994; 220:377–383. [PubMed] [Google Scholar]62. Ха TJ и др. Временные флуктуации резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя красителями, конъюгированными с одним белком. хим. физ. 1999; 247:107–118. [Google Академия] 63. Колкухун Д., Хоукс А.Г. In: Одноканальная запись. Сакманн Б., Неер Э., редакторы. Пленум Пресс; Нью-Йорк: 1995.стр. 397–482. [Google Академия]64. Ким Х.Д. и др. Mg2+-зависимое конформационное изменение РНК изучено с помощью корреляции флуоресценции и FRET на иммобилизованных одиночных молекулах. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:4284–4289. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]65. McKinney SA, Joo C, Ha T. Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования. Биофиз Дж. 2006; 91: 1941–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]66. Манро Д.Б., Альтман Р.Б., О’Коннор Н., Бланшар С.К. Идентификация двух различных промежуточных соединений гибридного состояния на рибосоме.Мол Ячейка. 2007; 25: 505–517. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]67. Myong S, Bruno MM, Pyle AM, Ha T. Пружинный механизм раскручивания ДНК геликазой NS3 вируса гепатита C. Наука. 2007; 317: 513–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]68. Ян Х, Се XS. Исследование динамики одиночных молекул фотон за фотоном. J Chem Phys. 2002; 117:10965–10979. [Google Академия] 69. Андрек М., Леви Р.М., Талага Д.С. Прямое определение кинетических скоростей по траекториям прибытия фотонов одной молекулы с использованием скрытых марковских моделей.J Phys Chem A. 2003;107:7454–7464. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]70. Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. Траектории максимального правдоподобия из экспериментов по резонансной передаче энергии флуоресценции одиночной молекулы. J Chem Phys. 2003; 119:9920–9924. [Google Академия] 71. Бланшар С.К., Гонсалес Р.Л., Ким Х.Д., Чу С., Пуглиси Д.Д. Отбор тРНК и кинетическая корректура в переводе. Nat Struct Mol Biol. 2004; 11:1008–1014. [PubMed] [Google Scholar]72. Смит Г.Дж., Сосник Т.Р., Шерер Н.Ф., Пан Т. Эффективное флуоресцентное мечение большой РНК посредством гибридизации олигонуклеотидов.РНК. 2005; 11: 234–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]73. Доривальска М. и соавт. Сайт-специфическое мечение рибосомы для спектроскопии одиночных молекул. Нуклеиновые Кислоты Res. 2005; 33: 182–189. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]74. Дениз А.А. и соавт. Сворачивание одиночной молекулы белка: диффузионно-флуоресцентные резонансные исследования переноса энергии денатурации ингибитора химотрипсина 2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97: 5179–5184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]75. Джагер М., Нир Э., Вайс С.Сайт-специфическое мечение белков для одномолекулярного FRET путем сочетания химической и ферментативной модификации. Белковая наука. 2006; 15: 640–646. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]76. Дейл Р.Е., Эйзингер Дж., Блумберг В.Е. Ориентационная свобода молекулярных зондов — фактор ориентации при внутримолекулярной передаче энергии. Биофиз Дж. 1979; 26: 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]77. Шулер Б., Липман Э.А., Штайнбах П.Дж., Кумке М., Итон В.А. Полипролин и «спектроскопическая линейка» в свете флуоресценции одиночных молекул.Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:2754–2759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]78. Ротвелл П.Дж. и соавт. Многопараметрическая флуоресцентная спектроскопия одной молекулы выявляет гетерогенность комплексов обратной транскриптазы ВИЧ-1: праймер/матрица. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100:1655–1660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]79. Расник И., Мён С., Ченг В., Лохман Т. М., Ха Т. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера реп-геликазы E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением: исследования одной молекулы флуоресцентно меченных ферментов.Дж Мол Биол. 2004; 336: 395–408. [PubMed] [Google Scholar]81. Кламм Дж. П., Дениз А. А. Трехцветная одномолекулярная резонансная передача энергии флуоресценции. Химфиз. 2005; 6: 74–77. [PubMed] [Google Scholar]82. Хайнце К.Г., Янц М., Швилле П. Анализ совпадений трех цветов: еще один шаг в следовании образованию молекулярных комплексов более высокого порядка. Биофиз Дж. 2004; 86: 506–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]83. Капанидис А.Н. и соавт. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий путем возбуждения одиночных молекул переменным лазером.Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:8936–8941. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]85. Ли Н.К. и др. Возбуждение одиночных молекул трехцветным переменным лазером: мониторинг множественных взаимодействий и расстояний. Биофиз Дж. 2007; 92: 303–312. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]86. Хейлеманн М. и соавт. Многоступенчатый перенос энергии в одиночных молекулярных фотонных проводах. J Am Chem Soc. 2004; 126:6514–6515. [PubMed] [Google Scholar]87. Ланг М., Фордайс П., Энг А., Нойман К., Блок С. Комбинированная флуоресцентная и силовая микроскопия.Biophys J. 2003;84:301a–301a. [Google Академия]88. Тарса П.Б. и др. Обнаружение индуцированных силой молекулярных переходов с флуоресцентным резонансным переносом энергии. Angew Chem Int Ed. 2007; 46:1999–2001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]89. Шрофф Х. и др. Биосовместимый датчик силы с оптическим считыванием и размерами 6 нм(3) Nano Lett. 2005; 5: 1509–1514. [PubMed] [Google Scholar]90. Хонг С. и др. Спектроскопия силы флуоресценции отображает двумерный реакционный ландшафт перекрестка Холлидея.Наука. 2007; 318: 279–283. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]92. Хармс Г.С. и соавт. Исследование конформационных изменений ионных каналов грамицидина с помощью одномолекулярной флуоресцентной микроскопии patch-clamp. Биофиз Дж. 2003; 85: 1826–1838. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]93. Тан Э. и др. Четырехстороннее соединение ускоряет свертывание рибозима в виде шпильки через дискретное промежуточное соединение. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:9308–9313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]94. Хаугланд Р. Справочник по флуоресцентным зондам и исследовательским продуктам.9-й. молекулярные зонды; Юджин, Орегон: 2002. [Google Scholar] 95. Jager M, Michalet X, Weiss S. Межбелковые взаимодействия как инструмент для сайт-специфического мечения белков. Белковая наука. 2005;14:2059–2068. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]96. Ратнер В., Кахана Э., Эйхлер М., Хаас Э. Общая стратегия двойной маркировки глобулярных белков для конкретных сайтов для кинетических исследований FRET. Биоконьюг Хим. 2002; 13:1163–1170. [PubMed] [Google Scholar]

Почему не у каждой гитары нулевой лад? — Страница 2

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

6 долларов.00 это много?

Для пластиковой гайки? да. Пластиковый порожек на гитаре не стоит, так что да, 6 долларов — это слишком много. Я думал, что каждый гитарист в мире знает, что пластиковые гайки — это дерьмо.

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️ когда-нибудь слышали о плате за обслуживание/работу/установку? Да, у меня есть. Так я зарабатываю на жизнь.

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

Вы не можете точно/вручную нарезать гайку с допуском 0,001. Ни в коем случае

Машинисты работают с допусками +-.001″. Все это знают. Почему так трудно поверить, что мастер может сделать то же самое? Я работаю с точностью до тысячной доли дюйма каждый день.

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

Откуда ты это знаешь?

Я знаю это, потому что я профессионально работаю с гитарами уже двадцать лет и сделал буквально тысячи порожков практически из всех доступных материалов, и пластик — худший из них.

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

серьезно? есть ли научная статья о кости против пластика…. мастер против NC? как это связано с тембром гитары? Также как насчет всех музыкантов 70-х-80-х годов, которые использовали медь, потому что ее было «трудно превзойти» тогда, когда кость не стала модной?? Почему PRS и другие производители используют синтетику для своих орехов, если кость лучше? Просто любопытно, какие есть научные доказательства того, что кость является предпочтительным материалом.

Шутки в сторону? Чувак — Если ты играешь на гитаре, как ты можешь не знать, насколько ужасны пластмассовые орехи? Кость плотная и твердая. Пластик мягкий и липкий. Это все научные доказательства, которые мне нужны.

Позвольте мне спросить вас: почему, по вашему мнению, лучшие инструменты из практически всех производителей гитар в мире (Fender, Martin, Gibson, Collings и т. д.) имеют костяной порожек ручной работы ? Если бы машина могла сделать что-то лучше, разве они не поставили бы вместо на гитары высокого класса?

К вашему сведению, компания PRS никогда не использовала, никогда не будет и никогда не будет использовать пластик в качестве материала для гаек. Есть действительно синтетических материалов, которые, возможно, ничуть не менее подходят как материал для орехов, так и кость.Пластик не входит в их число.

У вас сложилось впечатление, что прорезь для гайки прорезана до заданной глубины на основе некоторого набора спецификаций. Это неверно. Никто так не делает.

Даже в 21 веке, когда почти все гитарные грифы изготавливаются с очень одинаковыми допусками на станках и где большинство крупных производителей гитар (Martin, Gibson, Taylor, Fender и т. д.) действительно используют синтетические гайки машинного производства на своих Инструменты низкого и среднего ценового сегмента (костяная кость в дорогих и нестандартных моделях), накладки грифа и лады обрабатываются вручную , что означает, что расстояние между нижней частью верхнего порожка и нижней частью порожка варьируется от гитары к гитаре. даже на заводских приборах .По этой причине прорези для гаек преднамеренно оставлены высокими, а окончательная регулировка выполняется вручную — всегда .

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

, значит, вы думаете, что гайка ручной работы будет более точной, чем изготовленная на станке? с машинными допусками? извините не согласен. Вы не можете сделать гайку вручную, которая будет точнее, чем то, что может изготовить ЧПУ/принтер.

С точностью до каких характеристик? Каждая гитара уникальна, поэтому вам нужно будет перепрограммировать свою машину для каждого отдельного порожка.Все игроки разные, с разной техникой и разными ожиданиями. Как вы учитываете это в своем математическом уравнении? Опытный мастер принимает все это во внимание и изготавливает порожек соответственно для конкретной гитары , для конкретной толщины струны и для конкретного проигрывателя . Машина не может этого сделать — и точка. Гайки

для вторичного рынка, такие как Tusq, Graph-tech, Earvana, имеют увеличенный размер, поэтому все равно требуется, чтобы гайка была специально подогнана к прибору и прорезана до глубины, возможно, квалифицированным мастером , поэтому, если вас беспокоит человеческая ошибка , вероятность того, что человек закрутит один из них, так же высока, как если бы он сделал гайку с нуля.Кроме того, прорези этих гаек вторичного рынка имеют произвольные прорези с единым для всех интервалом. Квалифицированный мастер может вырезать прорези с интервалом , который лучше всего подходит для инструмента и исполнителя , а не с некоторым общим интервалом, заранее определенным каким-либо руководителем отдела маркетинга.

Как я уже говорил, даже самые продвинутые производители гитар с наиболее автоматизированным оборудованием оставляют окончательную регулировку глубины паза гайки на усмотрение мастера . Так что ваша логика ошибочна.

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

, так что я бы сказал, что 99% мастеров не могут даже сделать точную гайку, потому что это просто невозможно вручную с помощью обычных напильников и ручных режущих инструментов

Я не знаю, каков процент, но вы правы — большинство мастеров не могут. Хорошие могут работать и делают это точно, с «заурядными» (градуированными) напильниками, ручными режущими инструментами и электроинструментами. Если вы мне не верите, значит, вы никогда не встречали настоящего мастера.

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

Возможно, я не разбираюсь в современных ручных инструментах, доступных в домашнем складе

Есть такой инструмент — штангенциркуль. Он измеряется с точностью до тысячной дюйма. И лупы, которые делают маленькие вещи большими. Некоторые мастера используют щупы для гаек (я этого не делаю). Я считаю, что все эти предметы доступны в Home Depot.

Ювелирные надфили и надфили для гаек градуированы почти до тысячных долей дюйма. А еще есть этот инструмент: STEWMAC.COM — Измеритель прорези гаек … который измеряет глубину прорези гайки с точностью до тысячной доли дюйма, но я не использую ни один из них.

А с чего вы взяли, что мастера могут пользоваться только ручными инструментами? У меня целый магазин электроинструментов.

Цитата:

Первоначальное сообщение от chainrule ➡️

, может быть, вы можете объяснить мне процесс??

Это немного сложно, и этот пост становится довольно длинным, поэтому вот краткая версия:

Процесс начинается с навязчивого, навязчивого внимания к деталям и страсти к гитаре, за которым следует несколько лет вашей жизни, посвященных обучению у мастера. (Я работал под руководством мастера десять лет, прежде чем заняться собственным бизнесом).Как только вы приобретаете навыки и инструменты, вы получаете кусок коровьей бедренной кости, разрезаете его на заготовки для порожка и делаете порожек специально для этой конкретной гитары, для этой конкретной струны, для этого конкретного гитариста — подогнанные под заказ, изготовленные на заказ прорези, ручная форма и ручная полировка с чрезвычайно строгими допусками.

В ближайшие пару дней я собираюсь сделать два порожка — один обычный порожек и один для гитары без ладов. Если вы серьезно заинтересованы в обучении и насмехаетесь над перспективой человека, выполняющего точную работу, я мог бы сделать несколько фотографий и немного объяснить процесс по ходу дела.Но я закончил защищать свое ремесло. Дайте мне знать, если вы заинтересованы.

А пока загляните в эту тему, которую я начал некоторое время назад, когда недавно изготовил костяную компенсированную гайку ручной работы, для примера того, что может сделать человек с нужными инструментами и навыками: Ручная компенсированная костяная гайка

Между прочим, я несколько раз бодался здесь с Джоном Эппштейном, но его ответ на ваши замечания точен, и я согласен с ним по этому вопросу на 100%.

Как сделать светящиеся в темноте маркеры для ладов — инкрустация и переплет

Доступно несколько коммерческих люминесцентных маркеров.Готовые решения (например, от Luminlay) доступны в нескольких размерах или необработанных листах, стоимость которых превышает 20–30 долларов США плюс доставка, что достаточно для изготовления полного инструмента. Существует более временное решение в виде готовых наклеек, которые наклеиваются на существующие вставки, или листов винила с клейкой основой, которые можно обрезать до любой формы.

При относительно небольших затратах смехотворно легко изготовить несколько наборов собственных люминесцентных вкладок высокой интенсивности, даже делая размеры и формы, недоступные в продаже.Отливка собственных точек и некоторых простых маркеров боковых линий с использованием материалов, которые легко достать, дает высококачественную альтернативу готовым точкам.

Тебе понадобится:

• Люминесцентный порошок
• Двухкомпонентная эпоксидная смола или литейная смола хорошего качества
• Лист из полиэтилена высокой плотности, такой как кухонная разделочная доска
• Сверла, соответствующие размеру точки, которую нужно сделать
• Изоляционная лента

Люминесцентный порошок

Самое главное нам понадобится люминесцентный (светящийся в темноте) порошок.Его легко найти на множестве сайтов в сети, на eBay, Amazon и т. д. Порошки алюмината стронция (SrAl2O4) являются самыми яркими и светятся дольше всего, но могут давать только ограниченный диапазон цветов. Более «сложные» цвета, такие как красный, как правило, связаны с сульфидом оксида иттрия или сульфидом цинка. Они имеют более низкую яркость и время свечения, чем алюминат стронция. Порошки часто бывают разной степени крупности; зерна большего размера (обычно от 100 мкм до 250 мкм), как правило, ярче, чем самые мелкие сорта (~ 10 мкм).Все они одинаково подходят для этого урока, плюс смешивание цветов — это вариант, если вы хотите поэкспериментировать.

Порошок, используемый в этом уроке, представляет собой 20 г порошка Aqua Blue с размером зерна около 30-40 мкм. 20 г более чем достаточно, чтобы сделать несколько полных наборов маркеров для ладов. Это не должно стоить больше, чем несколько долларов/шекелей.

Эпоксидная смола или литьевая смола

Для литья вам понадобится обычная прозрачная смола, такая как эпоксидная смола или подобная двухкомпонентная система.Я буду использовать ZAP Z-Poxy 30min (PT-39), однако вы можете легко заменить его другим продуктом, таким как West System 105, литейной смолой, такой как Alumilite или аналогичной смолой холодного отверждения. Поищите энтузиастов RC или поставщиков и сайты для литья поделок; у них, как правило, есть много эпоксидных смол на складе, а также большой опыт их применения.

Z-Poxy 30min (PT-39) был выбран из соображений экономичности и доступности. Несмотря на то, что он разработан как клейкая эпоксидная смола, это свойство не имеет значения в данном контексте.Линия Z-Poxy также включает смолу для финишной обработки (PT-40) для укладки стекловолокна или углеродного волокна, которая также застывает за 30 минут. Это также было бы удовлетворительной альтернативой, однако, как правило, дороже.

Обычные эпоксидные клеи для самостоятельного ремонта вещей в доме (те, что в дозаторах для шприцев с двумя тюбиками, таких как Araldite и т. д.), в лучшем случае являются плохой заменой; качественная эпоксидная смола стоит примерно столько же, сколько эти ремонтные клеи потребительского класса, однако они, как правило, не поставляются в таких же малых количествах.Тем не менее, хорошая эпоксидная смола имеет множество применений в мастерской, так что это хорошая инвестиция, помимо этой одной работы.

Z-Poxy 30 минут стоил 21,50 евро за 8 жидких унций / 237 мл. Это около 3-4 глотков, однако это не безопасный или стандартный метод измерения. Это может показаться небольшим количеством или высокой ценой, но этого достаточно для нескольких мешков люминофора, и вы сможете выполнять множество различных работ. Большой плюс в том, что он высыхает прозрачным, имеет достаточное открытое время (30 минут для гелеобразования, еще несколько часов для полного отверждения) и не привередлив, если вы немного отклоните пропорции смешивания.

Лист из полиэтилена высокой плотности

Для формы мы будем использовать дешевую и общедоступную кухонную разделочную доску, сделанную из HDPE (полиэтилена высокой плотности). В отличие от большинства материалов, литьевые смолы и эпоксидные смолы плохо прилипают к полиэтилену высокой плотности, к тому же его довольно просто обрабатывать, что делает его идеальным выбором.

Очевидно, что большинство людей не слишком заботятся о том, из какого материала сделана их дешевая пластиковая разделочная доска, и, соответственно, производители не утруждают себя написанием этого на упаковке.Тем не менее найдите треугольный знак вторичной переработки (PIC), который идентифицирует тип пластика. Любой, помеченный цифрой «2» в центре, будет HDPE, и это может быть проштамповано под PIC. Полипропилен или LDPE могут работать, однако HDPE является более надежным вариантом и более устойчив к эпоксидным смолам.

Разделочная доска, которую я использовал, была толщиной чуть более 6 мм (1/4 дюйма) и обошлась мне в 4 евро за большую доску размером с журнал. Карманные деньги. Хотя мне не нужна форма такого размера, она обошлась дешевле, чем покупка меньший, который был на 1 евро дешевле.Я просто разорвал его по размеру на настольной пиле и оставил запасной для будущего использования.

Если вы хотите пойти на все, более экзотические полимеры, такие как СВМПЭ (полиэтилен сверхвысокой молекулярной массы) или ПТФЭ (политетрафторэтилен или тефлон), можно получить у многих поставщиков пластмасс в виде листов. Как правило, они будут дороже, чем более доступный HDPE, однако их смехотворно низкий коэффициент трения делает их идеальными для изготовления форм для эпоксидной смолы.Спросите, есть ли у них бесплатные обрезки или образцы.

——

Процесс относительно прост. Подготовьте форму. Смешайте одну часть эпоксидной смолы или литьевой смолы со светящимся порошком. Добавьте второй компонент и разлейте его по формам. Дайте ему высохнуть и вытолкните готовые детали. Давайте рассмотрим каждый этап более подробно.

Изготовление формы

ПНД легко обрабатывается с помощью деревообрабатывающих инструментов.При сверлении полиэтилен высокой плотности образует длинные спирали стружки, которые наматываются на сверло. Хотя это и не опасно, стоит время от времени очищать сверло от этой стружки. Скорость сверления должна быть снижена до очень низкой, так как при температуре выше 80°C/176°F HDPE начинает становиться мягким и плавиться. Это может привести к тому, что стружка снова приварится к заготовке. Маршрутизация ПНД аналогична. Самая низкая скорость, возможная на маршрутизаторе, приносит удовольствие, создавая небольшие сколы и чистую поверхность.

Круглые точки — самые распространенные и простые в приготовлении формы; просто просверлите HDPE насквозь сверлом соответствующего размера.Я установил простой шаблон на дрель для столба, чтобы прорезать набор отверстий 6,0 мм, 5,0 мм и 2,5 мм. Кондуктор представляет собой просто задний упор, сделанный из плоского куска ненужной доски, который позволяет вырезать отверстия по аккуратной линии. Совершенно не обязательно, однако это помогает ускорить работу и помогает максимально эффективно использовать пространство вокруг листа HDPE.

Стоит сделать больше отверстий для пресс-формы, чем вам может понадобиться.Любую неиспользованную эпоксидную смолу можно использовать для отливки запасных точек на случай, если какие-то из них окажутся неисправными. Форму можно будет использовать десятки раз, поэтому рекомендуется сделать упорядоченные наборы отверстий, соответствующие размерам маркеров, которые вы обычно используете или можете использовать в будущем.

Чтобы сделать закругленные боковые маркеры, в фрезер вставлена ​​простая фреза небольшого диаметра. Высота установлена ​​так, чтобы не прорезать всю доску насквозь.

На полпути все в порядке, и получится форма глубиной ~ 3 мм.Тем не менее, я знаю, что этот стол маршрутизатора плохой, а верхняя часть прогибается при использовании. Я ожидаю чуть более 4 мм разреза. К счастью, этот маршрутизаторный стол не мой….

Использование прямоугольного куска лома в качестве толкателя делает этот разрез безопасным, поскольку он слишком короткий, чтобы самостоятельно наткнуться на забор. Толкайте доской, удерживая заготовку вплотную к ней и прижимая обе к упору. После того, как разрез будет сделан, тяните обе части неуклонно назад.

Хороший. Две чистые формы с прорезями и закругленными концами… и они имели глубину около 4,5 мм, так что сегодня стол был особенно изогнутым….

Постепенно перемещая упор назад, вы делаете серию щелей на краю. Одна или две из этих прорезей были плохо прорезаны с небольшими укусами по бокам, нарушающими прямолинейность.Я закрашу их перманентным маркером, чтобы не использовать их.

Подготовка формы

Очистите форму тканью, смоченной денатурированным спиртом. После высыхания наклейте на формы малярный скотч, чтобы закрыть их. Для боковых маркеров создайте «дамбу», закрыв край до угла. Сложите ленту снизу и пригладьте ее к пластику пальцами.

Для сквозных отверстий достаточно полосок ленты, закрывающих нижнюю часть. Снова тщательно отшлифуйте ленту пальцами.

Замешивание эпоксидной смолы

Предварительно нагрейте смолу и отвердитель в теплой воде.Это помогает уменьшить толщину эпоксидной смолы, облегчая работу и уменьшая количество пузырьков.

При работе со смолами рекомендуется носить нитриловые перчатки. Эпоксидные смолы и отвердители являются сенсибилизаторами, вызывающими сыпь или другие неприятные вещи. Чем больше вы подвергаетесь им, тем больше вероятность того, что у вас будет реакция. Предупреждения на коробке не шутка. Держите поблизости тряпку и немного денатурированного спирта, чтобы убрать пролитую жидкость или случайное попадание на кожу.

В две чашки для смешивания отмерьте равные количества смолы и отвердителя. Следуйте инструкциям производителя по измерению; некоторые подходят по весу, а некоторые рекомендуются по объему. Придерживайтесь рекомендуемого правильного соотношения, насколько это возможно. В этом случае Z-Poxy 30-min рекомендует соотношение 1:1. Опыт подсказывает мне, что с обеих сторон есть небольшой фактор выдумки. Это довольно удобный продукт для работы.Эпоксидные смолы, такие как West System 105 (соотношение 5:1), имеют тенденцию быть немного менее щадящими.

Если вы планируете изготовить очень большое количество маркеров, рассмотрите возможность разделения работы на партии. Смолы отверждаются химически, и побочным продуктом этого процесса является экзотермическое тепло. К сожалению, процесс отверждения также ускоряется при нагревании! Смешивание больших партий отверждаемой смолы может легко привести к самоподдерживающемуся тепловому разгону, в результате чего смола закипит или даже загорится. В лучшем случае смесь начнет превращаться в гель еще до того, как вы закончите с ней работать.

Отмерьте приблизительно равный объем люминофора либо в смоле, либо в отвердителе. Я еще не решил, является ли какой-либо из них лучшим выбором для смешивания.

Вмешайте порошок с помощью палочки для перемешивания. Смесь станет гуще и начнет складываться по мере того, как порошок втирается в нее.Нанесите смесь на любой сухой или влажный остаток, разделив и снова сложив ее, пока она не станет полностью однородной и смешанной. Поскребите бока и дно, чтобы убедиться, что ничего не вытекло. Полученная смесь должна легко выскабливаться из контейнера, оставляя мало следов.

Смешайте это со вторым компонентом и снова полностью соедините. Соскребите стенки и дно контейнера, чтобы удалить любые неподатливые карманы. Часы тикают. Для Z-Poxy 30-min открытое время (не время отверждения) составляет около 30 минут.Поскольку мы немного нагрели компоненты, чтобы сделать их более работоспособными, это может быть немного меньше, чем заявлено. Тем не менее, у нас более чем достаточно времени, чтобы отлить несколько комплектов.

Пора на работу

Используйте шпажку для шашлыка или что-то подобное, вытащите комок смеси из чашки.Позвольте этому стекать с конца палочки в целевую форму. Не так уж важно быть суперточным. Помните, что часы тикают! Любые недоливы или переливы не имеют большого значения, к тому же эпоксидная смола осядет.

Через несколько минут вся форма была заполнена, а избыток эпоксидной смолы остался. Расточительство, что является настоящим позором. Я должен был сделать набор форм побольше, но у меня все равно будет жуткая светящаяся чашка.Я использовал палочку, чтобы соскребать излишки с формы, и палочку для коктейля, чтобы проверить, нет ли в мельчайших точках пузырьков. Теплая эпоксидная смола текла хорошо и там, где она должна была быть, вообще без пузырьков. Отлично.

В завершение возьмите лезвие канцелярского ножа (подойдет и небольшой резиновый скребок), чтобы убрать излишки с поверхности. Я держал лезвие примерно под углом 45°, чтобы вдавить излишки в форму для лучшего заполнения.Что касается боковых маркеров, перетаскивание под углом 45° к направлению маркеров, когда лезвие царапало поперек, помогло предотвратить подъем эпоксидной смолы из форм. Когда эпоксидная смола начинает схватываться, ей нравится «схватываться» и пытаться вытащить себя.

Хорошо, все выглядит хорошо. Было ощущение, что с эпоксидной смолой становится все труднее работать, а излишек в чашке казался теплым на ощупь.Это признак того, что процесс отверждения запущен; экзотермическое тепло химической реакции. Время, чтобы оставить его chooch.

Через несколько часов эпоксидка была более-менее готова. Добавление наполнителей, таких как люминесцентные порошки, может повлиять на абсолютное время отверждения, однако Z-Poxy 30-min все равно через три часа кажется сверхтвердым леденцом, несмотря на это. Форму промывали в теплой воде, а малярный скотч отклеивался или стирался по мере намокания.Эпоксидная смола водостойкая, поэтому стирка не влияет на маркеры.

Выдавливание первой точки размером 6,0 мм показывает стабильное заполнение формы без пузырьков. Эта точка составляет более или менее полную толщину формы; намного глубже, чем вкладки действительно должны быть. Лучше, чем слишком мелко, конечно!

Самый простой способ выдавить точки — поместить форму поверх рулона малярной ленты или другой плоской опорной поверхности с пустым участком посередине.Выталкивание точек из верхней части формы казалось более сложным, чем из задней части.

Линии боковых маркеров немного отличаются. Сгибание формы слегка «растрескивает» любую адгезию между формой и эпоксидной смолой. Уговоры ногтем или плоской отверткой легко их удаляют.

Результат! На одной из самых маленьких (2,5 мм) точек был пузырь, однако в этом раунде выход был почти 100%.

Пора начинать собирать коллекции. Там, откуда они взялись, будет больше куч, так как здесь использовалось небольшое количество эпоксидной смолы. Стоимость этих вкладышей составляет долю любых коммерческих эквивалентов, к тому же они намного толще.

После кратковременной зарядки вкладышей с помощью лампочки вкладыши сильно светятся! Дневной свет содержит больше ультрафиолета, что является лучшим вариантом для зарядки люминесцентных вкладок.Мой светодиодный фонарик с черным светом еще не прибыл вовремя для публикации; их можно купить за пару долларов на eBay или где угодно. Черные или УФ-светодиоды и заряжают люминесцентные вставки очень быстро и сильно! Помните о предупреждениях о воздействии на глаза прямого ультрафиолетового излучения….

Точки можно установить почти так же, как и любые другие; отверстие, просверленное до соответствующего размера и вклеенное каплей цианоакрилатного клея.Точки из эпоксидной смолы хорошо реагируют на шлифовку перед шлифовкой и полировкой вместе с остальной частью грифа. Цвет слегка бежевый с зеленоватым оттенком.

ОБНОВЛЕНИЕ . Точки стали слишком яркими после кратковременной зарядки с помощью ручки со светодиодной подсветкой:

Помните горшок с отработанной эпоксидной смолой? Вот как он сияет при дневном свете .

Альтернативные методы

Вы не ограничены отливкой маркеров в формы из полиэтилена высокой плотности или использованием эпоксидной смолы в качестве связующего для люминесцентного порошка.

Эпоксидная смесь прекрасно работает, заливая ее непосредственно в латунную, медную или стерлинговую серебряную трубку, создавая металлический контур точки. Просто оберните малярным скотчем внешнюю часть трубки, чтобы она оставалась чистой, и залейте эпоксидной смолой прямо внутрь.

Участник форума Крис Верховен снял фантастическое видео о прямом литье фотолюминесцентных точек. Вместо того, чтобы отливать маркеры отдельно, Крис заполняет точки люминесцентным люминесцентным порошком и впитывает цианоакрилатный клей, чтобы зафиксировать порошок.